ICS67.040 C53 中华人民共和国国家标准 GB/T5009.33一2003 代替GB/T5009.33-1996 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 Determination of nitrite and nitrate in foods 2003-08-11发布 2004-01-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布 259
GB/T5009.33-2003 前·言 本标准代替GB/T5009.33一1996《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法》。 本标准与GB/T5009.33一1996相比主要修改如下： 一修改了标准的中文名称，标准中文名称改为《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》； 一一对方法的内容进行了修改： -按照GB/T20001.4一2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》对原标准的结构进行了 修改。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准盐酸紫乙二胺法、镉柱法由卫生部食品卫生监督检验所、河南省食品卫生监督检验所、吉林 省卫生防疫站、青岛医学院负责起草。 本标准示波极谱法由华中师范大学、湖北省食品卫生监督检验所、武汉同济医科大学负贵起草。 本标准于1985年首次发布，于1996年第一次修订，本次为第二次修订. 260
GB/T5009.33-2003 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 1范围 本标准规定了食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法。 本标准适用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定。亚硝酸盐方法检出限为1g/kg,硝酸盐方法检 出限为1.4mg/kg。 盐酸萘乙二胺法·一亚硝酸盐测定 2原理 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙 二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。 3试剂 3.1亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾[K,Fe(CN)6·3H20],用水溶解，并稀释至1000mL。 3.2乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌[2(CHC00)2·2H2O],加30mL冰乙酸溶于水，并稀释 至1000mL。 3.3饱和硼砂溶液：称取5.0g硼酸钠(Na2B,O,·10H2O),溶于100mL热水中，冷却后备用。 3.4对氨基苯磺酸溶液(4g/L):称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100L20%盐酸中，置棕色瓶中混 匀，避光保存。 3.5盐酸萘乙二胺溶液(2g/L):称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶解于100mL水中，混匀后，置棕色瓶中， 避光保存。 3.6亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入 500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于2004g的亚硝酸钠。 3.7亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL,置于200mL容量瓶中，加水稀 释至刻度，此溶液每毫升相当于5.04g亚硝酸钠。 4仪器 4.1小型绞肉机。 4.2分光光度计。 5分析步骤 5.1试样处理 称取5.0g经绞碎混匀的试样，置于50mL烧杯中，加12.5mL硼砂饱和液，搅拌均匀，以70℃左 右的水约300mL将试样洗人500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min,取出后冷却至室温，然后一面 转动，一面加入5L亚铁领化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇 匀，放置0.5h,除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL,滤液备用。 5.2测定 吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、 2.00、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5g亚硝酸钠），分别置于 261
GB/T5009.33-2003 50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2L对氨基苯磺酸溶液(4g/L),混匀，静置 3min~5min后各加人1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L),加水至刻度，混匀，静置15min,用2cm比色 杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较，同时做试剂空白。 6结果计算 试样中亚硝酸盐的含量按式(1)进行计算。 X=AX1000 …(1) n×兰x100 式中： X-试样中亚硝酸盐的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); m—试样质量，单位为克(g)； A一一测定用样液中亚硝酸盐的质量，单位为微克(g)。 V1一试样处理液总体积，单位为毫升(mL); V2一测定用样液体积，单位为毫升(mL)。 计算结果保留两位有效数字。 7精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 镉柱法一硝酸盐测定 8原理 试样经沉淀蛋白质、除去脂防后，溶液通过镉杜，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸 性条件下，亚硝酸根与对氨苯基磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总 量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。 9试剂 9.1氨缓冲溶液(pH9.6~9.7):量取20mL盐酸，加50mL水，混匀后加50mL氨水，再加水稀释至 1000mL,混匀。 9.2稀氨缓冲液：量取50mL氨缓冲溶液，加水稀释至500mL,混匀。 9.3盐酸溶液(0.1mol/L):吸取5mL盐酸，用水稀释至600mL。 9.4硝酸钠标准溶液：准确称取0.1232g于110℃~120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于500mL 容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于2004g亚硝酸钠。 9.5硝酸钠标准使用液：临用时吸取硝酸钠标准溶液2.50mL,置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻 度。此溶液每毫升相当于54g亚硝酸钠。 9.6亚硝酸钠标准使用液同3.7。 10仪器 10.1镉柱 10.1.1海绵状镉的制备：投人足够的锌皮或锌棒于500mL硫酸镉溶液(200g/L)中，经3h~4h,当 其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻法 多洗涤，然后移人组织捣碎机中，加500mL水，捣碎约2s,用水将金属细粒洗至标准筛上，取 262
GB/T5009.33一2003 20目~40目之间的部分。 10.1.2镉柱的装填：如图1。用水装满镉柱玻璃管，并装入2cm高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底 时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下加入海绵状镉至8cm~10cm高，上面用1cm高的 玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。 如无上述镉柱玻璃管时，可以25mL酸式滴定管代用。 当镉柱填装好后，先用25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25mL,镉柱不用时用水 封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。 30 5 6 50 1-一贮液漏斗，内径35mm,外径37mm: 2一进液毛细管，内径0.4mm,外径6mm; 3—橡皮塞： 4-一镉柱玻璃管，内径12mm,外径16mm 5、7一玻璃棉； 6一一海缩状镉； 8一一出液毛细管，内径2mm,外径8mm。 图1 10.1.3镉柱每次使用完毕后，应先以25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25mL,最后 用水覆盖镉柱。 10.1.4镉柱还原效率的测定：吸取20mL硝酸钠标准使用液，加入5mL稀氨缓冲液，混匀后依照 11.2.2~11.2.3进行操作。取10.0mL还原后的溶液（相当104g亚硝酸钠）于50mL比色管中，以下 按5.2进行操作，根据标准曲线计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于98%为符合要求。 10.1.5结果计算：还原效率按式(2)进行计算。 X=0×10% tte*4t+…(2) 263
GB/T5009.33-2003 式中： X—一还原效率： A-- 一测得亚硝酸盐的质量，单位为微克(g); 10—测定用溶液相当亚硝酸盐的质量，单位为微克(g)。 11分析步骤 11.1试样处理 同5.1. 11.2测定 11.2.1先以25mL稀氨缓冲液冲洗镉柱，流速控制在3mL/min~5mL/min(以滴定管代替的可控 制在2mL/min~3mL/min). 11.2.2吸取20mL处理过的样液于50mL烧杯中，加5mL氨缓冲溶液，混合后注入贮液漏斗，使流 经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流完后，再加5L水置换柱内留存的样液。 11.2.3将全部收集液如前再经镉柱还原一次，第二次流出液收集于100L容量瓶中，继以水流经镉 柱洗涤三次，每次20mL,洗液-一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混匀。 11.2.4亚硝酸钠总量的测定：吸取10mL~20mL还原后的样液于50mL比色管中，以下按5.2自 “吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00…”起依法操作。 11.2.5亚硝酸盐的测定：吸取40mL经11.1处理的样液于50mL比色管中，以下按5.2自“吸取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00…”起依法操作。 12结果计算 试样中硝酸盐的含量按式(3)进行计算。 A1×1000 42×1000 X三 x×100mxx10 ×1.232 ……(3) 式中： X一试样中硝酸盐的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); m一试样的质量，单位为克(g)； A,一一经镉粉还原后测得亚硝酸钠的质量，单位为微克(4g): A2一一直接测得亚硝酸盐的质量，单位为微克(4g); 1.232一亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数； V1一测总亚硝酸钠的试样处理液总体积，单位为毫升(L); V2一一测总亚硝酸钠的测定用样液体积，单位为毫升(mL); V。一经镉柱还原后样液总体积，单位为毫升(mL); V,一经镉柱还原后样液的测定用样液体积，单位为毫升(mL); V一直接测亚硝酸钠的试样处理液总体积，单位为毫升(L): V。一直接测亚硝酸钠的试样处理液的测定用样液体积，单位为毫升(L)。 计算结果保留两位有效数字。 13精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 264
GB/T5009.33-2003 示波极谱法—亚硝酸盐测定 14原理 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氨化后，在弱碱 性条件下再与8羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氨染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐 的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。 15试剂 15.1亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾[K,Fe(CN)6·3H2O],用水溶解，并稀释 至1000mL。 15.2乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌[Zn(CH,COO)2·2H2O],加30mL冰乙酸溶于水，并稀释 至1000mL。 15.3饱和硼砂溶液：称取5.0g硼酸钠(Na2B,O,·10H2O),溶于100mL热水中，冷却后备用。 15.4对氨基苯磺酸溶液(8g/L):称取2g对氨基苯磺酸，用热水溶解，再加25mL盐酸 (1.0mol/L),移至250mL容量瓶稀释至刻度。 15.58-羟基喹啉溶液(1g/L):称取0.250g8-羟基喹啉，加4mL盐酸(0.1mol/L)和少量水溶解， 移至250mL容量瓶稀释至刻度。 15.6EDTA溶液(0.10mol/L):称取3.722 EDTA[CoH14N2OgNa·2H2O],加水30mL溶解， 转人100mL容量瓶中用水稀释至刻度。 15.7氨水(5%：吸取28%的浓氨水5.00mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。 15.8亚硝酸盐标准溶液：准确称取0.1000g于硅胶千燥器中24h的亚硝酸钠，加水溶解移入 500mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于200g亚硝酸钠。 15.9亚硝酸钠标准使用液：准确吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL于200mL容量瓶中，加水稀释至刻 度，此溶液每毫升相当于5g亚硝酸钠。再取10.00mL该稀释液于100mL容量瓶中，加水稀释至 刻度，此溶液每毫升相当于0.54g的亚硝酸钠。 16仪器 16.1小型绞肉机。 16.2示波极谱仪。 17分析步骤 17.1试样处理 称取5.000g经绞碎混匀的试样（午餐肉、火腿肠可称10.00g~20.00g),置于50mL烧杯中， 加12.5mL硼砂饱和液，搅拌均匀，以70℃的水300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中 加热15min,取出后冷却至室温，然后-一面转动，一面加人5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL 乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置0.5h,除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初 滤液50mL,滤液备用。 17.2测定 吸取3mL上述滤液于10mL容量瓶（或比色管）中，另取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、 3.00mL亚硝酸钠标准溶液（相当于0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50μg亚硝酸钠）于10mL容量 瓶（或比色管）中，于标准与试样管中分别加人0.20 mL EDTA溶液(0.10mol/L)、1.50mL对氨基苯 磺酸溶液(8g/L),混匀，静止3min~4min后各加入1.00mL8-羟基喹啉溶液(1g/L)和0.5mL氨 265
GB/T5009.33-2003 水(5%)，用水稀释至刻度，混匀，静止10min~15min,将试液全部转入电解池中(10mL小烧杯)。 在示波极谱仪上采用三电极体系进行测定（滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极 为辅助电极)。 17.3测定参考条件 原点电位调节在一0.2V; 倍率为0.1（可以根据试样中亚硝酸盐含量多少选择合适的倍率。含量高，倍率高，倍率选择在 0.1以上；反之，倍率选择在0.1以下)。 电极开关拨至三电极，导数档。 测量开关拔至阴极。 将三电极插人电解池中，每隔7s仪器自行扫描一次，在荧光屏上记录一0.56V左右（允许电位 波动10mV~20mV)的极谱波高，绘制标准曲线比较。 18结果计算 试样中亚硝酸盐的含量按式(4)进行计算。 AX1000 X=m×(W/V)X1000×1000 **…(4) 式中： X一试样中亚硝酸盐的含量，单位为克每千克(g/kg): A一一测定用样液中亚硝酸盐的质量，单位为微克(4g)； V1一一试样溶液的总体积，单位为毫升(mL)； V2一测定用样液的体积，单位为毫升(mL); m一试样质量，单位为克(g)。 计算结果保留两位有效数字。 19精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 266