酵母表达系统 优点 1属于真核生物可进行翻译后修饰如糖基化 2操作容易 3经济 4快速
1 酵母表达系统 优点 1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化 2 操作容易 3 经济 4 快速
酵母细胞结构 细胞壁 细肥膜 枝 液泡 液泡粒 贮藏粒
2 酵母细胞结构
两种酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 毕赤酵母 Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris 过去常用 现在多用
3 两种酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 Saccharomyces cerevisiae 过去常用 毕赤酵母 Pichia pastoris 现在多用
Pichia pastoris表达系统 Pichia pastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一 的碳源 易操作培养容易 表达量高,可达培养液中10g/L 可以有真核生物的翻译后修饰,如糖基化 ·避免了酿酒酵母的过糖基化问题
4 Pichia pastoris 表达系统 • Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一 的碳源. • 易操作,培养容易 • 表达量高, 可达培养液中10 g/L • 可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化 • 避免了酿酒酵母的过糖基化问题
Multi-Copy Pichia Expression Kit For the Isolation and Expression of Recombinant Proteins from Pichia pastoris Strains Containing Multiple Copies of a Particular Gene Catalog no. K1750-01 (iNvitrogen life technologies www.invitrogen.com techservice@invitrogen.com
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1. Pichia pastoris的表达载体 胞内表达载体 胞外表达载体 3 AOX1 TT) Bg儿L Sac I AOX1(TT) OX Sal I Sal I pAO815 Stu I pPIC9K 9.3 kb 7. 7 kb P pastoris没有稳定的附加体质粒,所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体
6 1. Pichia pastoris 的表达载体 胞内表达载体 胞外表达载体 P. pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体
Alcohol oxidase,醇孽氧化酶,将甲醇氧化成甲醛 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子 AOX1 AOX2 是主要的酶 利用甲醇的能力低 生长慢 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
7 Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子 AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达 AOX2 利用甲醇的能力低 生长慢
histidinol dehydrogenase gene(his4 (二)选择性标记基因 1.营养缺陷标记基因HⅠS4HⅠS4是 Hi合成过程中所需的组氨酸脱氢酶基因, 宿主细胞毕赤酵母是采用组氨酸脱氢酶缺陷 型。整合后的细胞可在不含His的培养基上 生长。 宿主H4突变,不能合成组氨酸,在His缺陷培养基上不能生长; 质粒上有His4,可合成组氨酸,用His缺陷平板筛选转化菌株
8 宿主His4突变，不能合成组氨酸，在His缺陷培养基上不能生长； 质粒上有His4, 可合成组氨酸，用His缺陷平板筛选转化菌株。 histidinol dehydrogenase gene (his4)
2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR Map of pAo815 The figure below shows the map of pAO815. Details of the multiple cloning site are shown on page 10. The sequence is located after page 3 AOX1 (TT) Bgl ll OX1 BamH I Comments for pAO815: 7709 nucleotides 5 A0XI promoter fragment: bases 1-940 5 A0XI primer site: bases 855-875 pAO815 Sal I Stu I EcoR I Site: bases 943.948 3AOX/ primer site: bases 1024-1044 3'/ transcription 7. 7 kb termination (IT): bases 950-1277 HIS4 ORF: bases 4199-1665 3 AOXI fragment: bases 4554-5310 ColEl origin: bases 6394-5740 Ampicillin resistance gene: bases 7399-6539 Bgl‖l 3'AOX1
9 2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR
胞内表达载体,pAO815 AOXI mRNA" end(824) 5 AOX I primer site(855-875 82 TTATCATCAT TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC 87 AAGCTTTTGA TTTTAACGAC T AC GAC AACTTGAGAA GATCAAAAAA EcoR I 92 CAACTAATTA TTCGAAACGA GGAATTCGC TTAGACATGA CTGTTCCTCA 97 GTTCAAGTTG GGCACTTACG AGAAGACCGG TCTTGC TAGA TTCTAATCAA 3 AOr I primer site(1024-1044) 102 GAGGATGTCA GAATGCCATT TGCCTGAGAG ATGCAGGCTT CATTTTTGAT AOXl mRNA 3 end (1115) 107 ACTTTTTTAT TTGTAACCTA TATAGTATAG GATTTTTTTT GTCATTTTGT
10 胞内表达载体, pAO815