南京发业火学动物生物化学实验实验七动物肝脏DNA的提取动物医学院动物生化教研室
1 实验七 动物肝脏DNA的提取 动物医学院动物生化教研室 动物生物化学实验
一、实验目的了解从动物组织中提取DNA的一般原理；1掌握DNA提取的方法和步骤。2
2 ① 了解从动物组织中提取DNA的一般原理； ② 掌握DNA提取的方法和步骤。 一、实验目的
二、实验原理》利用不同浓度的氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白(DNP)和核糖蛋白(RNP)的溶解度不同,使两者分离。同时利用SDS使DNA与蛋白质分开,利用氯仿-异戊醇去除蛋白质使DNA溶于浓盐溶液中,再用高浓度的乙醇使DNA析出
3 二、实验原理 利用不同浓度的氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白(DNP) 和核糖蛋白(RNP)的溶解度不同,使两者分离。同时利用 SDS使DNA与蛋白质分开,利用氯仿-异戊醇去除蛋白质, 使DNA溶于浓盐溶液中,再用高浓度的乙醇使DNA析出
主要试剂及其作用EDTA螯合Mg2+、Ca2+等金属离子》DNase作用时需要一定的金属离子作辅基》抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用■SDS》抑制核糖核酸酶的作用溶解细胞膜上的脂质与蛋白，溶解膜蛋白而破坏细胞膜与蛋白质结合成为R-0-SO3-·R十-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来
4 EDTA 螯合Mg2＋ 、Ca2＋等金属离子 DNase作用时需要一定的金属离子作辅基 抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用 SDS 抑制核糖核酸酶的作用 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，溶解膜蛋白而破坏细胞膜 与蛋白质结合成为R-O-SO3-.R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质 变性而沉淀下来 主要试剂及其作用
■氯仿》强蛋白质变性剂，使液相与有机相分开>抑制DNA酶的活性■异戊醇》消除抽提过程中出现的泡沫95%乙醇》沉淀DNA
5 氯仿 强蛋白质变性剂，使液相与有机相分开 抑制DNA酶的活性 异戊醇 消除抽提过程中出现的泡沫 95%乙醇 沉淀DNA
三、实验步骤■取材取出冻肝，待溶化后，称取3g，剪成碎块匀浆>加入5mL0.14mo1/LNaC1-0.15mo1/LEDTA-Na溶液充分匀浆；》匀浆液倒入50mL的玻璃烧杯中；》再加10mL上述溶液洗涤匀浆杯，倒入杯中；》匀浆液平均分为两份，3000rpm离心10min，弃上清
6 取材 取出冻肝,待溶化后,称取3g,剪成碎块. 匀浆 加入5 mL 0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na溶液充分匀浆; 匀浆液倒入50mL的玻璃烧杯中； 再加10 mL 上述溶液洗涤匀浆杯,倒入杯中； 匀浆液平均分为两份,3000rpm离心10min,弃上清. 三、实验步骤
DNA提取取出两试管，弃上清后，向每根试管中分别加5mL0.14mo1/LNaC1-0.15mo1/LEDTA-Na溶液;搅匀倒入50mL的玻璃烧杯中。再滴加1mL25%SDS，边滴边搅拌10min；加入3mL5mo1/LNaC1溶液（终浓度为1.07mo1/L），继续搅拌10min；加入（14mL）一倍体积的氯仿-异戊醇混合液.于带磨口塞的锥形瓶中震摆20min;3000rpm离心15min，分为三层：上层一———-水相中间层--蛋白质下层一有机相小心用皮头滴管吸取上层水相于小烧杯中，加入2倍体积的95%的乙醇，静置；将DNA丝状物缠绕在玻棒上
7 DNA提取 取出两试管,弃上清后，向每根试管中分别加５mL 0.14mol/L NaCl- 0.15mol/L EDTA-Na溶液;搅匀倒入５０mL的玻璃烧杯中． 再滴加1mL 25% SDS,边滴边搅拌10min； 加入3mL 5mol/L NaCl溶液(终浓度为1.07mol/L),继续搅拌10min; 加入(14mL)一倍体积的氯仿-异戊醇混合液.于带磨口塞的锥形瓶中震摆 20min; 3000rpm离心15min,分为三层: 上层-水相 中间层-蛋白质 下层-有机相 小心用皮头滴管吸取上层水相于小烧杯中,加入 2 倍体积的95%的乙醇,静 置；将DNA丝状物缠绕在玻棒上
四、思考题①用95%酒精提抽DNA时为什么要轻轻搅动；②结合本人操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解
8 ① 用95%酒精提抽DNA时为什么要轻轻搅动; ② 结合本人操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子 DNA的降解. 四、思考题