南京业火学动物生物化学实验000009·E实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白动物医学院动物生化教研室
1 实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白 动物医学院动物生化教研室 动物生物化学实验
一、实验目的D掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理：2学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术：③了解血清蛋白的主要成份。C
2 ① 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理； ② 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； ③ 了解血清蛋白的主要成份。 一、实验目的
二、 实验原理》不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开
3 二、实验原理 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓 缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行 ，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开
1、聚丙烯酰胺凝胶生成TEMED催化AP生成硫酸自由基催化Acr聚合成长链CONH,CONH,CONH,CONH,CONH,SO,+nCH,=CHCH,CH-CH,-CH-CH,-CHCH-CH（Acr单体长链）(Acr)Bis将单体长链连成网状结构Acr：丙烯酰胺CONH,CONHCONH,CHCH,-SHCHBis：甲叉双丙烯酰胺（Acr单体长链）AP：过硫酸胺（催化剂）CONHCONH,CHHCH.-CHHTEMED：N,N,N',N'-四甲基乙二胺(CONHCONH加速剂)CH:pHCONHCONHCONHCONHCH-CH,CH-CH,-CH-CH,-CHCH,Acr、Bis决定孔径大小CONHAP、TEMED决定聚合速度CCONH,CONHCONH,[CH,CH—CH,CHCH-CH,-CHOHCONHCONH三维两状极胶4
4 Bis将单体长链连成网状结构 TEMED催化AP生成硫酸自由基 1、聚丙烯酰胺凝胶生成 催化Acr聚合成长链 Acr：丙烯酰胺 Bis：甲叉双丙烯酰胺 AP：过硫酸胺（催化剂） TEMED： N, N, N′,N′-四甲基乙二胺（ 加速剂） Acr、Bis决定孔径大小 AP、TEMED决定聚合速度
2、连续胶和不连续胶电泳连续胶电泳采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。优点：美》制胶简单、快捷》缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀》缓冲系统组成简单，来源广泛缺点：》分辨率不高
5 连续胶电泳 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液 和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。 优点： 制胶简单、快捷 缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀 缓冲系统组成简单，来源广泛 缺点： 分辨率不高 2、连续胶和不连续胶电泳
不连续胶电泳采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。●优点：》分辨率高》用于复杂和特殊样品的分离
6 不连续胶电泳 采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由 于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后 在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。 优点： 分辨率高 用于复杂和特殊样品的分离
不连续电泳的四种不连续体系Iris/甘氮酸pH8.9>凝胶的不连续>缓冲液成份的不连续浓缩胶>缓冲液pH值的不连续TnsHapH6.7样品缓冲浓液>电压梯度的不连续TrisHapH6.7分离肤Iris/HapH8.9不连续电泳的三种物理效应》样品的浓缩效应Tris/甘氨酸pH8.9凝胶的分子筛效应电荷效应电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离
7 不连续电泳的三种物理效应 样品的浓缩效应 凝胶的分子筛效应 电荷效应 电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组 分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。 不连续电泳的四种不连续体系 凝胶的不连续 缓冲液成份的不连续 缓冲液pH值的不连续 电压梯度的不连续
三、实验步骤■封槽清洁、干燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上
8 三、实验步骤 封槽 清洁、干燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上
制胶和灌胶分离胶：A:C:D:E=1:2:3:2（V/V）浓缩胶：B:C:D:E=2:1:5:2（V/V）A：pH8.9Tris/Hcl缓冲液B:pH6.7Tris/Hcl缓冲液C:30%Acr-Bis贮存液D: 水E：过硫酸铵灌装前加入TEMED，混匀》取干净玻璃管，下端封口膜封好（重要）；用注射器加分离胶至管口1-2cm处，封水（沿管壁，动作要慢）；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口2-3mm处、封水；凝固后备用
9 分离胶：A:C:D:E＝1:2:3:2（V/V） 浓缩胶：B:C:D:E＝2:1:5:2（V/V） A: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液 B: pH6.7 Tris/Hcl缓冲液 C: 30% Acr-Bis贮存液 D: 水 E: 过硫酸铵 灌装前加入TEMED，混匀 取干净玻璃管，下端封口膜封好（重要）；用注射器加分离胶至管口1- 2cm处，封水（沿管壁，动作要慢）；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口 2-3mm处、封水；凝固后备用。 制胶和灌胶
加样用微量注射器取样品液14μ1，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，缓慢注入。■电泳》连接电极，上负下正；浓缩胶：3mA/管，分离胶：4mA/管；》待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。剥胶取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水冲洗几次。10
10 加样 用微量注射器取样品液14μl，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上， 缓慢注入。 电泳 连接电极，上负下正； 浓缩胶：3mA／管，分离胶：4mA／管； 待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。 剥胶 取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之 间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的 一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏 水冲洗几次