F南京发业火学动物生物化学实验H22实验二蛋白质的定量测定双缩脲法测定蛋白质浓度动物医学院动物生化教研室
1 实验二 蛋白质的定量测定 -双缩脲法测定蛋白质浓度 动物医学院动物生化教研室 动物生物化学实验
实验目的学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法-掌握分光光度仪的使用方法掌握Excel软件制作标准曲线2C
2 ① 学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法 ② 掌握分光光度仪的使用方法 ③ 掌握Excel软件制作标准曲线 一、实验目的
二、实验原理蛋白质含量：蛋白质混合物中蛋白质的含量或总蛋白质含量目前常用的方法1）凯氏定氮法紫外吸收法2）分光光度法染料结合法比色法：双缩豚法lFolin-酚法
3 二、实验原理 蛋白质含量：蛋白质混合物中蛋白质的含量或总蛋白质含量 目前常用的方法 1）凯氏定氮法 紫外吸收法 2）分光光度法 染料结合法 比色法：双缩脲法 Folin-酚法
1.分光光度法的基本原理及方法分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。根据测定时所用的光源波长的不同，分光光度法可分为可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等几种。物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。t紫蓝如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收，则溶液呈黑色。青蓝绿青
4 1. 分光光度法的基本原理及方法 分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、 定量分析的一种方法。根据测定时所用的光源波长的不同，分光光度法可分 为可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等几种。 物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了 某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。 如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为无色透明； 如溶液对所有颜色的光全部吸收，则溶液呈黑色
物质呈现的颜色吸收光颜色波长范围（nm)紫黄绿380—435蓝黄435—480橙黄绿蓝480—500绿红紫500—560紫黄绿560—580蓝黄580—595橙绿蓝595—650红蓝绿650—760
5 物质呈现的颜色 吸收光 颜色 波长范围（nm) 黄 绿 紫 380－435 黄 蓝 435－480 橙 黄 绿蓝 480－500 红 紫 绿 500－560 紫 黄绿 560－580 蓝 黄 580－595 绿蓝 橙 595－650 蓝绿 红 650－760
（1）利用吸收光谱对物质进行定性分析物质的吸收光谱与物质分子结构有关。》吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度（A），然后以波长（入）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图，可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。>在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（入max）。物质不同，它们的最大吸收波长也往往不同。常用的方法有：比较吸收光谱曲线法、比较最大吸收波长法、比较吸光度的比值
6 （1）利用吸收光谱对物质进行定性分析 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光 测定物质的吸光度（A），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度 （A）为纵轴，按结果作图，可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线 体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收 光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸 收波长（λmax）。物质不同，它们的最大吸收波长也往往不同。 常用的方法有：比较吸收光谱曲线法、比较最大吸收波长法、比较吸光 度的比值
（2）利用吸收光谱对物质进行定量分析Beer-Lambert定律一吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。T=I/IoA=Ig1/T=IgIo/I=-KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I.为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
7 Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚 度成正比。 T=I/I0 A=Ig1/T=IgI0/I=KCL 其中：T为透光率； A为吸光率； I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度； L为溶液光程的厚度 （2）利用吸收光谱对物质进行定量分析
标准曲线法A=Ig1/T=IgI./I=KCL0. 6y= 0.1092x + 0.0216R2 = 0.99780. 5配制一系列不同浓度的标准溶液，测定时先以0. 40.3空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系0. 2列的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标0. 1作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线0264mg/ml（或称A-C曲线）。图1蛋白标准曲线图比较法对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。A标=K标C标L标C测=A测IA标×C标A未知=K测C测L测
8 标准曲线法 A=Ig1/T=IgI0/I=KCL 配制一系列不同浓度的标准溶液，测定时先以 空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系 列的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标 作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线 （或称A-C曲线）。 比较法 对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良 好直接比较测定结果。 A标 =K标C标L标 A未知 =K测 C测 L测 y = 0.1092x + 0.0216 R 2 = 0.9978 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 2 4 6 mg/ml OD值 C测 =A测 /A标 ×C标 图1 蛋白标准曲线图
分光光度计的基本构造及原理IntensityofIntensityofittec0.012一MonochromatoDetectoLampSwithtofabsorbingBpecies测量器样品室单色器受光器光源仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显示出吸光度（A）或透光度（T）
9 光 源 单色器 样品室 受光器 测量器 仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光 （入射光）进入样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生 光电流，放大后在测量仪上显示出吸光度（A）或透光度（T）。 分光光度计的基本构造及原理
2.双缩法测定蛋白质浓度的基本原理①）具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。②蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。③在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。H,OO=CNH2NH2HNOB-CFCH-RC=OCuoHNNHNH2R-CH+NH3个CH-RNHH.ONH2加热180℃?紫色络合物OCONH2NH210
10 ① 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与 Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的 浓度。 ② 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称 为双缩脲反应。 ③ 在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定 蛋白质浓度。 NH O NH NH O NH C C NH O NH O NH C C 加热180 C? o +NH 2 2 2 2 2 2 3 2. 双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理