实验七脱辅基血红蛋白的制备和重组 、实验目的 1.了解生物化学中典型的血红蛋白的性质和结构以及结合在蛋白上的辅基的作用。 2.学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质代换金属离子的方法 3.学习快速扫描分光光度计的使用及紫外可见吸收光谱的应用 4.学习柱层析和透析袋脱盐的方法 二、实验原理 血红蛋白( Hemoglobin)是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种 结合蛋白,它是由四个亚基组成的四聚体,分子量大约为65000。四个亚基中,两个亚基 具有相同的氨基酸序列,称为a一亚基,每条链含141个氨基酸,另外两个氨基酸序列 相同的亚基,称为β一亚基,各含146个氨基酸。两种亚基有其各自的二级、三级空间 结构,亚基之间以非共价键结合在一起。每个亚基中均含有一个血红素辅基,血红素是 一个铁原卟啉Ⅳ,它处于一个疏水环境,此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非 常重要的作用。Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的,若被氧化成Fe(ⅢD,则 称为高铁血红蛋白,它就失去了可逆载氧功能。 血红素辅基与血红蛋白均以非共价键相连,其中包括Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上 的Nε上的配位键:卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白氨基酸侧链之间的盐桥;以及卟啉环中 乙烯基与蛋白的疏水相互作用。在酸性条件下,由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱, 以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。利用高铁血红素在丁酮中的溶 解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质,用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分 离。分离得到的脱辅基血红蛋白( ApoHb)可以用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟 啉、铜卟啉等)进行重组,生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。 由于高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱中,在405m处有很强的特征吸收峰,而脱 辅基血红蛋白只在280nm处有蛋白的特征吸收峰,当将高铁血红素加入 ApoHb溶液中后, 重组成功的高铁血红蛋白又会在405mm处出现它的特征吸收峰,因而血红蛋白的脱辅基 与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测 三、实验方法 1.氧合血红蛋白的制备供全班学生使用) 在市血站购买一袋人血,用高速冷冻离心机4000/min离心10min,取下层血球加四
209 实验七 脱辅基血红蛋白的制备和重组 一、实验目的 1. 了解生物化学中典型的血红蛋白的性质和结构以及结合在蛋白上的辅基的作用。 2. 学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质代换金属离子的方法。 3. 学习快速扫描分光光度计的使用及紫外可见吸收光谱的应用。 4. 学习柱层析和透析袋脱盐的方法。 二、实验原理 血红蛋白(Hemoglobin)是由二价铁 Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种 结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为 65000。四个亚基中，两个亚基 具有相同的氨基酸序列，称为α—亚基，每条链含 141 个氨基酸，另外两个氨基酸序列 相同的亚基，称为β—亚基，各含 146 个氨基酸。两种亚基有其各自的二级、三级空间 结构，亚基之间以非共价键结合在一起。每个亚基中均含有一个血红素辅基，血红素是 一个铁原卟啉Ⅳ，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非 常重要的作用。Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2 价还原态存在的，若被氧化成 Fe(Ⅲ)，则 称为高铁血红蛋白，它就失去了可逆载氧功能。 血红素辅基与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括 Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上 的 Nε上的配位键；卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白氨基酸侧链之间的盐桥；以及卟啉环中 乙烯基与蛋白的疏水相互作用。在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱， 以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。利用高铁血红素在丁酮中的溶 解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分 离。分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟 啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。 由于高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱中，在 405nm 处有很强的特征吸收峰，而脱 辅基血红蛋白只在 280nm 处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入 ApoHb 溶液中后， 重组成功的高铁血红蛋白又会在 405nm 处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基 与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。 三、实验方法 1. 氧合血红蛋白的制备(供全班学生使用) 在市血站购买一袋人血，用高速冷冻离心机 4000r/min 离心 10min，取下层血球加四
倍体积的09%NaCl洗血球,再用4000/min离心10min,如此重复2~3次,取下层血 球,按1:∶1(Vw)体积比加甲苯,振荡2分钟以上,使血球破膜,800r/min离心20mnin, 弃去上层甲苯和中层脂肪,取下层血球沉淀,加10分之一沉淀体积的9%NaCl,激烈振 荡混合,4000r/min离心10min,弃沉淀,取上层红黑色血红蛋白溶液,再用8000r/min 离心 10min,弃上层,取下层血红蛋白溶液用滤纸过滤,因过滤很慢,可放4℃冰箱内过 滤过夜,然后装透析袋,4℃对H2O透析除NaCl和甲苯,换2~3次予冷的H2O,由透 析袋内取出血红蛋白溶液置入一锥形瓶,取样分析血红蛋白(Hb)的浓度:取5uHb,加 30mlH2O稀释601倍),用分光光度计作250m~700m的扫描,并检测Hb在415rm 54nm和576m处的三个特征峰值:A415、As41和A5,已知这三个特征峰的吸光系数值 E415=125 I/mmol、E541=13.5mmol、576=14.6mmol。 由公式:浓度C=(AX稀释倍数)E,即可计算出制备的氧合血红蛋白Hb的浓度Chbe 2.氧合血红蛋白Hb)氧化成高铁血红蛋白 取已知浓度(约3~6mmo/L)的氧合血红蛋白2ml,置于5m小烧杯或10ml试管内 放入冰浴,用下式计算需加入过量1.3倍的KFe(CN6的量(l0mg/m)(M=329.26) Cm×2×32926 1.3(m1) 10×10 用移液管吸取所需加入的KFe(CN)6,在缓慢搅拌下滴入Hb内,直到血红蛋白的颜 色从鲜红色变成棕黑色。 装一根1.8cm×2cm的 Sephadex G-25凝胶脱盐柱,用l0 mmol/L pH70的磷酸盐缓 冲液平衡脱盐柱,将制成的高铁血红蛋白溶液全部上柱,用4℃H2O洗脱,用量筒收集高 铁血红蛋白,再用H2O将其稀释至10~1.5mmo/L(因为过浓不利于脱辅基,太稀又会 脱不完全),记录总体积,取样稀释200~300倍,作250~700nm的扫描,得重组前高 铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱图,检测峰值Ao5 3脱辅基(以下步骤均在冰浴或4℃下进行) 高铁血红蛋白用10mo/LHCl粗调,再用0. I mol/L HCl细调溶液pH=1.8~20(这 步是关键,pH太高,脱辅基不完全,pH过低蛋白会变性),将溶液置入具塞试管内,加 入等体积予冷丁酮,手摇振荡萃取,静止分层,弃上层丁酮,取下层溶液,如此反复萃 取几次,直至上层丁酮无色为止。 取下层浅绿色脱辅基后蛋白溶液装透析袋,4℃对1L5 mmol/L NahCO3透析0.5 210
210 倍体积的 0.9% NaCl 洗血球，再用 4000r/min 离心 10min，如此重复 2～3 次，取下层血 球，按 1∶1(v/v)体积比加甲苯，振荡 2 分钟以上，使血球破膜，8000r/min 离心 20min， 弃去上层甲苯和中层脂肪，取下层血球沉淀，加 10 分之一沉淀体积的 9% NaCl，激烈振 荡混合，4000r/min 离心 10min，弃沉淀，取上层红黑色血红蛋白溶液，再用 8000r/min 离心 10min，弃上层，取下层血红蛋白溶液用滤纸过滤，因过滤很慢，可放 4℃冰箱内过 滤过夜，然后装透析袋，4℃对 H2O 透析除 NaCl 和甲苯，换 2～3 次予冷的 H2O，由透 析袋内取出血红蛋白溶液置入一锥形瓶，取样分析血红蛋白(Hb)的浓度：取 5l Hb，加 3.0ml H2O(稀释 601 倍)，用分光光度计作 250nm～700nm 的扫描，并检测 Hb 在 415nm、 541nm 和 576nm 处的三个特征峰值：A415、A541和 A576，已知这三个特征峰的吸光系数值 为： 415 =125 l/mmol、541 =13.5 l/mmol、576 =14.6 l/mmol。 由公式： 浓度 C=(A×稀释倍数)/ ，即可计算出制备的氧合血红蛋白 Hb 的浓度 CHb。 2. 氧合血红蛋白(Hb)氧化成高铁血红蛋白 取已知浓度(约 3～6 mmol/L)的氧合血红蛋白 2 ml，置于 5 ml 小烧杯或 10 ml 试管内 放入冰浴，用下式计算需加入过量 1.3 倍的 K3Fe(CN)6 的量 (10mg/ml)(Mw=329.26)： 1.3( ) 10 10 2 329.26 3 ml C V Hb ＝ 用移液管吸取所需加入的 K3Fe(CN)6，在缓慢搅拌下滴入 Hb 内，直到血红蛋白的颜 色从鲜红色变成棕黑色。 装一根 1.8cm×22cm 的 Sephadex G-25 凝胶脱盐柱，用 10mmol/L pH7.0 的磷酸盐缓 冲液平衡脱盐柱，将制成的高铁血红蛋白溶液全部上柱，用 4℃H2O 洗脱，用量筒收集高 铁血红蛋白，再用 H2O 将其稀释至 1.0～1.5mmol/L (因为过浓不利于脱辅基，太稀又会 脱不完全)，记录总体积，取样稀释 200～300 倍，作 250～700nm 的扫描，得重组前高 铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱图，检测峰值 A405。 3.脱辅基 (以下步骤均在冰浴或 4℃下进行) 高铁血红蛋白用 1.0mol/L HCl 粗调，再用 0.1mol/L HCl 细调溶液 pH=1.8～2.0 (这一 步是关键，pH 太高，脱辅基不完全，pH 过低蛋白会变性)，将溶液置入具塞试管内，加 入等体积予冷丁酮，手摇振荡萃取，静止分层，弃上层丁酮，取下层溶液，如此反复萃 取几次，直至上层丁酮无色为止。 取下层浅绿色脱辅基后蛋白溶液装透析袋，4℃对 1L 5 mmol/L NaHCO3 透析 0.5～
1h,以除HCl,再对H2O(4℃)透析两次,以除丁酮,再对4℃200ml0.lmol/LpH7.0 磷酸盐缓冲液透析1h,中间取出透析袋倒置二次(此时会出现少量白色变性蛋白沉淀) 取出袋内溶液,用800r/min离心l0min(4℃),取上层清液,测体积(脱辅基血红蛋 白 ApoHb),立即存于冰浴。取样稀释10~20倍,作250m-70nm扫描,作峰检测得 A28蛋白吸收峰值,(以0. Imol/L pH70磷酸盐缓冲液作参比)。计算脱辅基血红蛋白( ApoHb 的浓度 CApoHb: A23×稀释倍数 13.1 (u mol/ml) (ApoHb B] E278=13. 1 L/mmol 4.重组高铁血红蛋白 取30 ml ApoHb,用0.01mo/ L Naoh配制5mg/ml的高铁血红素( Hemin,Mw=6515), 计算 Hemin的加入量(过量1.5倍): =40b×3×6515 5×103 缓慢搅拌下,用10~15min滴加所需体积的 Hemin到30 mI ApoHb中,并在冰浴中 再放置1h,用1 mol/L Naoh粗调和0 Imol/L NaOH细调溶液pH=9~10,溶液颜色变为 棕黑色。 再用G-25脱盐柱脱去过量的 Hemin等,脱盐柱用0 I moI/L pH70磷酸盐缓冲液平衡 和洗脱,用量筒收集重组后的高铁血红蛋白,测量总体积,取样稀释后作250nm~700m 扫描,测峰值A405,最后计算重组率 重组率=重组后Asx稀释倍数x体积xB 重组前A15×稀释倍数x体积 B=脱辅基后所得4p(Bb的总体积 重组所用ApOb的总体积 由扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图,可以清楚地看到血红蛋白脱辅基前后和重 组后的效果
211 1 h，以除 HCl，再对 H2O(4℃)透析两次，以除丁酮，再对 4℃ 200 ml 0.1mol/L pH7.0 磷酸盐缓冲液透析 1 h，中间取出透析袋倒置二次（此时会出现少量白色变性蛋白沉淀）。 取出袋内溶液，用 8000r/min 离心 10 min(4℃)，取上层清液，测体积(脱辅基血红蛋 白 ApoHb)，立即存于冰浴。取样稀释 10～20 倍，作 250nm-700nm 扫描，作峰检测得 A278蛋白吸收峰值，(以0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液作参比)。计算脱辅基血红蛋白(ApoHb) 的浓度 CApoHb： ( ) 13.1 278 mol ml A CApoHb μ ／ 稀释倍数 ＝ （ApoHb 的 278=13.1 L/mmol） 4. 重组高铁血红蛋白 取 3.0ml ApoHb，用 0.01mol/L NaOH 配制 5mg/ml 的高铁血红素(Hemin，Mw=651.5) ， 计算 Hemin 的加入量(过量 1.5 倍)： 1.5( ) 5 10 3 651.5 3 ml C V ApoHb ＝ 缓慢搅拌下，用 10～15min 滴加所需体积的 Hemin 到 3.0ml ApoHb 中，并在冰浴中 再放置 1 h，用 1mol/L NaOH 粗调和 0.1mol/L NaOH 细调溶液 pH=9～10，溶液颜色变为 棕黑色。 再用 G-25 脱盐柱脱去过量的 Hemin 等，脱盐柱用 0.1mol/L pH7.0 磷酸盐缓冲液平衡 和洗脱，用量筒收集重组后的高铁血红蛋白，测量总体积，取样稀释后作 250nm～700nm 扫描，测峰值 A405，最后计算重组率： 重组前 稀释倍数 体积 重组后 稀释倍数 体积 重组率＝ 405 405 A A B 重组所用 的总体积 脱辅基后所得 的总体积 ＝ ApoHb ApoHb B 由扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图，可以清楚地看到血红蛋白脱辅基前后和重 组后的效果