8免疫化学技术 8.1免疫化学技术简介 现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成、结构以及抗原和抗体反应的机制。此外,还研 究体内其他免疫活性物质,如补体分子的组成、结构及其功能。目前,免疫化学已应用于免 疫性疾病发病机制的基础研究和临床检测等, 随着免疫化学、细胞生物学及分子生物学的进展,免疫学实验技术也迅猛发展,并已成 为当今生命科学研究的重要手段,尤其是在医学基础研究和临床实践中得到广泛应用 免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定。前者主要是根据抗原与相应抗体 能在体外发生特异性结合,并在一些辅助因子的参与下出现沉淀、凝集及溶解等反应,从而 采用已知抗原检测未知抗体,或用已知抗体检测未知抗原。此外,尚包括检测体液中各种可 溶性免疫分子,诸如补体、各类免疫球蛋白、循环免疫复合物、溶菌酶、各种细胞因子等 细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞(T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等) 表面所具有的独特标志及其各自的特殊功能,在体外(有时亦可在体内)测定上述各种细胞 及其亚群的数量和功能,以帮助了解机体的细胞免疫水平。 本章节仅限于介绍几种主要的免疫化学实验技术的基本原理及实验操作方法 8.2抗原的免疫原性和专一性 抗原与兔疫原:抗原( antiger,Ag)是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应 答,并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质, 也称为免疫原( Immunogen)。前一种性能称为免疫原性( Immunogenicity)或抗原性 ( antigenicity),后一种性能称为反应原性( reactogenicity)或免疫反应性( Immunoreactivity) 抗原的分类:根据抗原物质所具备的性能可分为完全抗原( complete antigen)和半抗原 ( hapten)两类。同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原,如细菌、病毒、异 种动物血清等。仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性,而无免疫原性的物质 称为半抗原,如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质,它们本身不具免疫原性,但当 与蛋白质大分子结合后形成复合物,便获得了免疫原性,这种与半抗原结合并赋予它免疫原 性的蛋白质大分子称为载体( carrier)。根据抗原的来源不同可分为外源性抗原与内源性抗 原。外源性抗原是从外界引入体内而刺激机体发生免疫应答的。内源性抗原是指体内的自身 成分,如机体的组织或细胞因理化因素作用或病毒感染使这些成分发生改变或修饰,成为一 种自身抗原或称新生抗原,使机体发生免疫反应。而根据抗原的化学组成可分成蛋白质、糖 类、脂类与核酸等抗原
153 8 免疫化学技术 8.1 免疫化学技术简介 现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成、结构以及抗原和抗体反应的机制。此外，还研 究体内其他免疫活性物质，如补体分子的组成、结构及其功能。目前，免疫化学已应用于免 疫性疾病发病机制的基础研究和临床检测等。 随着免疫化学、细胞生物学及分子生物学的进展，免疫学实验技术也迅猛发展，并已成 为当今生命科学研究的重要手段，尤其是在医学基础研究和临床实践中得到广泛应用。 免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定。前者主要是根据抗原与相应抗体 能在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子的参与下出现沉淀、凝集及溶解等反应，从而 采用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未知抗原。此外，尚包括检测体液中各种可 溶性免疫分子，诸如补体、各类免疫球蛋白、循环免疫复合物、溶菌酶、各种细胞因子等。 细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞（T 细胞、B 细胞、K 细胞、NK 细胞及巨噬细胞等） 表面所具有的独特标志及其各自的特殊功能，在体外（有时亦可在体内）测定上述各种细胞 及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。 本章节仅限于介绍几种主要的免疫化学实验技术的基本原理及实验操作方法。 8.2 抗原的免疫原性和专一性 抗原与免疫原：抗原（antigen,Ag）是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应 答，并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质， 也称为免疫原（immunogen）。前一种性能称为免疫原性（immunogenicity）或抗原性 （antigenicity），后一种性能称为反应原性（reactogenicity）或免疫反应性（immunoreactivity）。 抗原的分类：根据抗原物质所具备的性能可分为完全抗原（complete antigen）和半抗原 （hapten）两类。同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原，如细菌、病毒、异 种动物血清等。仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质 称为半抗原，如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当 与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，这种与半抗原结合并赋予它免疫原 性的蛋白质大分子称为载体（carrier）。根据抗原的来源不同可分为外源性抗原与内源性抗 原。外源性抗原是从外界引入体内而刺激机体发生免疫应答的。内源性抗原是指体内的自身 成分，如机体的组织或细胞因理化因素作用或病毒感染使这些成分发生改变或修饰，成为一 种自身抗原或称新生抗原，使机体发生免疫反应。而根据抗原的化学组成可分成蛋白质、糖 类、脂类与核酸等抗原
构成免疫原的条件:异物性是抗原物质的首要性质。免疫活性细胞在正常情况下具有高 度精确的识别能力,能识别“自己”和“非己”,将非己物质加以排斥。免疫应答就其本质 来说,就是识别异物和排斥异物的应答,故激发免疫应答的抗原一般需要是异物,具有异物 性的物质可分为以下几种:1)异种物质:马血清、异种蛋白质、各种微生物及其代谢产物, 对人来说是异种物质,均为良好抗原。2)同种异体物质:高等动物同种不同个体之间,由 于遗传基因不同,其组织成分的化学结构也有差异。因此,同种异体物质也可以是抗原物质。 例如人类红细胞A、B、O血型物质和人类白细胞抗原( human leukocyte antigen, HLA)即 属此类。3)自身抗原:自身组织成分通常无抗原性,但在某些异常情况下,自身成分也可 成为抗原物质。 抗原一般为大分子物质,其分子量在10kD以上。在一定范围内,分子量越大,其抗原 性越强。分子量在5kD以下的肽类,一般无抗原性,分子量为5-10kD的肽类为弱抗原。 抗原须是大分子物质的原因为:1)分子量越大,表面的抗原决定簇越多,而淋巴细胞要求 有一定数量的抗原决定簇的刺激才能活化。2)大分子胶体物质的化学结构稳定,不易被破 坏和清除,在体内停留时间较长,能持续刺激淋巴细胞 大分子物质并不一定都有抗原性。例如明胶是蛋白质,分子量达100kD以上,但其免 疫原性很弱。因明胶所含成分为直链氨基酸,不稳定,易在体内水解成低分子化合物。如在 明胶分子中加入少量酪氨酸则能增强其抗原性。因此,抗原物质除应为大分子外,其表面必 须有一定的化学组成和结构。此外,抗原分子的构象( conformation)即抗原分子中一些特 殊化学基因的三维结构,它决定该抗原分子是否能与相应淋巴细胞表面的抗原受体互相吻 合,从而启动免疫应答。抗原分子的构象变化,可导致其抗原性的改变。抗原的物理性状与 免疫原性的强弱有关。一般具有环状结构的蛋白质其抗原性比直链分子强:聚合状态的蛋白 质较其单体抗原性为强;颗粒性抗原较可溶性抗原为强。 具备上述性状的物质须经非消化道途径进入机体(包括注射、吸入、混入伤口等),并 接触免疫活性细胞,才能成为良好抗原。 抗原特异性的物质基础:抗原决定簇( antigenic determinant AD)是存在于抗原表面的 特殊基团,又称表位( epitope)。抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合, 从而激活淋巴细胞,引起免疫应答,抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合 因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构,也是免疫反应具有特异性的物质基础。一个 抗原分子可具有一种或多种不同的抗原决定簇,每种决定簇只有一种抗原特异性。抗原决定 簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位。一般蛋白质的决定簇由5-6个氨基酸残基组成
154 构成免疫原的条件：异物性是抗原物质的首要性质。免疫活性细胞在正常情况下具有高 度精确的识别能力，能识别“自己”和“非己”，将非己物质加以排斥。免疫应答就其本质 来说，就是识别异物和排斥异物的应答，故激发免疫应答的抗原一般需要是异物，具有异物 性的物质可分为以下几种：1）异种物质：马血清、异种蛋白质、各种微生物及其代谢产物， 对人来说是异种物质，均为良好抗原。2）同种异体物质：高等动物同种不同个体之间，由 于遗传基因不同，其组织成分的化学结构也有差异。因此，同种异体物质也可以是抗原物质。 例如人类红细胞 A、B、O 血型物质和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）即 属此类。3）自身抗原：自身组织成分通常无抗原性，但在某些异常情况下，自身成分也可 成为抗原物质。 抗原一般为大分子物质，其分子量在 10kD 以上。在一定范围内，分子量越大，其抗原 性越强。分子量在 5kD 以下的肽类，一般无抗原性，分子量为 5－10kD 的肽类为弱抗原。 抗原须是大分子物质的原因为：1）分子量越大，表面的抗原决定簇越多，而淋巴细胞要求 有一定数量的抗原决定簇的刺激才能活化。2）大分子胶体物质的化学结构稳定，不易被破 坏和清除，在体内停留时间较长，能持续刺激淋巴细胞。 大分子物质并不一定都有抗原性。例如明胶是蛋白质，分子量达 100kD 以上，但其免 疫原性很弱。因明胶所含成分为直链氨基酸，不稳定，易在体内水解成低分子化合物。如在 明胶分子中加入少量酪氨酸则能增强其抗原性。因此，抗原物质除应为大分子外，其表面必 须有一定的化学组成和结构。此外，抗原分子的构象（conformation）即抗原分子中一些特 殊化学基因的三维结构，它决定该抗原分子是否能与相应淋巴细胞表面的抗原受体互相吻 合，从而启动免疫应答。抗原分子的构象变化，可导致其抗原性的改变。抗原的物理性状与 免疫原性的强弱有关。一般具有环状结构的蛋白质其抗原性比直链分子强；聚合状态的蛋白 质较其单体抗原性为强；颗粒性抗原较可溶性抗原为强。 具备上述性状的物质须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并 接触免疫活性细胞，才能成为良好抗原。 抗原特异性的物质基础：抗原决定簇（antigenic determinant, AD）是存在于抗原表面的 特殊基团，又称表位（epitope）。抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合， 从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。一个 抗原分子可具有一种或多种不同的抗原决定簇，每种决定簇只有一种抗原特异性。抗原决定 簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位。一般蛋白质的决定簇由 5－6 个氨基酸残基组成
一个多糖决定簇由5—7个葡萄糖残基组成,一个核酸半抗原的决定簇包含6-8个核苷酸 抗原结合价( antigenic valence)指能与抗体分子结合的决定簇的总数,包括抗原表面功 能价及其内部非功能价。 8.3抗体的结构和功能 抗体是机体受抗原刺激后,由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异 性结合的球蛋白,因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白( Immunoglobulin)。在免疫应答 过程中,抗体主要由分化的B淋巴细胞产生,但有时也需要其他类型的细胞,如T淋巴细 胞和巨噬细胞的协同作用。抗体主要分布在体内血清中或外分泌液中,对体液免疫应答起主 要作用。目前已发现的人免疫球蛋白有五类,分别为lgG、lgA、lgM、lgD和Ig。免疫球 蛋白最显著的特点是与抗原特异性结合以及其分子的不均一性。 各种不同类别的免疫球蛋白分子都含有四条多肽链组成的基本结构单位,即由两条重链 ( heavy chain,H链)和两条轻链( light chain.,L链)通过不同数目的二硫键结成Y形(见 图81)。在抗体分子的N端,不同抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的,此区为“多 变区”( variable region,Ⅴ区),它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位。由于抗体多变区这 结构特点,决定了它对抗原分子“识别功能”的多样性:不同抗体分子的C端结构基本 恒定,称为“稳定区”( constant region,C区)。当抗原与抗体结合时,抗体分子发生变构效 应和集聚作用,使稳定区的某些部位暴露出来,并立即发生一系列免疫生理效应,如固定补 体,促进对抗原分子的吞噬、溶解和清除作用 图8-1IgG1的基本结构 The basic structure of igG1 variabie region 450 residues light chain (212 residues
155 一个多糖决定簇由 5－7 个葡萄糖残基组成，一个核酸半抗原的决定簇包含 6－8 个核苷酸。 抗原结合价（antigenic valence）指能与抗体分子结合的决定簇的总数，包括抗原表面功 能价及其内部非功能价。 8.3 抗体的结构和功能 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异 性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白（Immunoglobulin）。在免疫应答 过程中，抗体主要由分化的 B 淋巴细胞产生，但有时也需要其他类型的细胞，如 T 淋巴细 胞和巨噬细胞的协同作用。抗体主要分布在体内血清中或外分泌液中，对体液免疫应答起主 要作用。目前已发现的人免疫球蛋白有五类，分别为 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。免疫球 蛋白最显著的特点是与抗原特异性结合以及其分子的不均一性。 各种不同类别的免疫球蛋白分子都含有四条多肽链组成的基本结构单位，即由两条重链 （heavy chain, H 链）和两条轻链（light chain, L 链）通过不同数目的二硫键结成 Y 形（见 图 8-1）。在抗体分子的 N 端，不同抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的，此区为“多 变区”（variable region, V 区），它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位。由于抗体多变区这 一结构特点，决定了它对抗原分子“识别功能”的多样性；不同抗体分子的 C 端结构基本 恒定，称为“稳定区”（constant region, C 区）。当抗原与抗体结合时，抗体分子发生变构效 应和集聚作用，使稳定区的某些部位暴露出来，并立即发生一系列免疫生理效应，如固定补 体，促进对抗原分子的吞噬、溶解和清除作用。 图 8-1 IgG1 的基本结构
Fig 8-1. The N-terminal end of IgGl is characterized by sequence variability(V) in both the heavy and light chains, referred to as the VH and Vi regions respectively. The rest of the molecule has a relatively constant(C) structure. The constant portion of the light chain is armed the Cl region. The constant portion of the heavy chain is further divided into three structurally discrete regions: Chl, CH2 and ch3. These globular regions, which are stabilized by intrachain disulphide bonds, are referred to as 'domains'. The sites at which the antibody binds antigen are located in the variable domains. The hinge region is a segment of heavy chain between the CHI and CH2 domains. Flexibility in this area permits the two antigen-binding sites to operate independently. There is close pairing of the domains except in the Ch2 region. Carbohydrate moieties are attached to the Ch2 domains. 免疫球蛋白在血清自由电泳图谱中主要分布在r一球蛋白区域,因此以前有人把r一球 蛋白误认为就是抗体。其实r一球蛋白不全是抗体,而抗体也不全在r一球蛋白区域内(见 图8-2)。 8-2人血清免疫球蛋白的分布 Distribution of the major human immunoglobulins albumin electrophoretic mobility Fig8-2 Electrophoresis of human serum showing the distribution of the four major immunoglobulin classes. Serum proteins are separated according to their charges in an electric field, and classified as al, a2, B and y, depending on their mobility(lge class has a similar mobility to lgd but cannot be represented quantitatively because of its low level in serum). lgg exhibits most charge heterogeneity, the other classes having a more restricted mobility in theβ and fa8
156 Fig 8-1. The N-terminal end of IgG1 is characterized by sequence variability(V) in both the heavy and light chains, referred to as the VH and VL regions respectively. The rest of the molecule has a relatively constant(C) structure. The constant portion of the light chain is termed the CL region. The constant portion of the heavy chain is further divided into three structurally discrete regions: CH1, CH2 and CH3. These globular regions, which are stabilized by intrachain disulphide bonds, are referred to as ‘domains’. The sites at which the antibody binds antigen are located in the variable domains. The hinge region is a segment of heavy chain between the CH1 and CH2 domains. Flexibility in this area permits the two antigen-binding sites to operate independently. There is close pairing of the domains except in the CH2 region. Carbohydrate moieties are attached to the CH2 domains. 免疫球蛋白在血清自由电泳图谱中主要分布在г－球蛋白区域，因此以前有人把г－球 蛋白误认为就是抗体。其实г－球蛋白不全是抗体，而抗体也不全在г－球蛋白区域内（见 图 8-2）。 图 8-2 人血清免疫球蛋白的分布 Fig8-2 Electrophoresis of human serum showing the distribution of the four major immunoglobulin classes. Serum proteins are separated according to their charges in an electric field, and classified as 1, and depending on their mobility. (IgE class has a similar mobility to IgD but cannot be represented quantitatively because of its low level in serum). IgG exhibits most charge heterogeneity, the other classes having a more restricted mobility in the and fa8
8.4抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应( serologic reaction),因抗体主要存在于血清中,试 验时一般都采用血清标本,故名。但抗原抗体反应亦常用于细胞免疫测定,如对淋巴细胞表 面分化抗原的鉴定。因此,血清学一词已被广义的抗原抗体反应所取代 抗原与抗体在体外结合时,可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种 反应,例如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等。在此基础上进行改进,又衍生出许多快速 而灵敏的抗原抗体反应,例如从凝集反应衍生出间接凝集、反向间接凝集、凝集抑制试验、 协同凝集试验等;从沉淀反应结合电泳,衍生出免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。此 外,还有各种免疫标记技术,如免疫荧光、酶免疫测定、放射免疫、免疫电镜及发光免疫测 定等 抗原抗体结合具有高度特异性,即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发 生反应。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型,而抗体的特异性则取决 于抗体 Ig Fab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体不是通过共价键,而 是通过很弱的短矩引力而结合,如范德华引力( Van der waal' s attraction force)、静电引力 ( electrostatic force)、氢键( hydrogen bond)及疏水性作用( hydrophobic effect)等。 范德华引力与两种相互作用的分子或原子间的距离七次方成反比(F2=1/d7),即两者 越靠近,此引力越大。这种引力能否最大限度地发挥作用,关键在于分子的空间构型。抗原 与抗体分子的互补空间关系有助于该引力发挥作用,它可增加两种分子结合在一起的倾向 形成特异性抗原抗体复合物。若一个分子在形态上有一个凹陷,它能准确地与另一分子突出 的基因互补,如同抗原一抗体、酶一底物系统的活性部位的相互作用,这种相互作用可产生 最强的 Van der Waal接触。 静电引力又称库仑引力( Coulumbic attraction force)发生在带有相反电荷的基团之间, 例如NH3与COO之间。这种结合力的强度与两个相互作用基团间的距离平方成反比(F2 1/d2)。若两个分子间有可能发生电荷转移的部位,该部位也可能产生静电引力 氢键可在共价键结合的氢原子间产生。氢原子可与一个带负电荷的原子共价结合,再与 另一个带负电荷原子的非共价电子相互作用,就形成了氢键。例如 O…H-0一 氢键较弱,键能的大小取决于方向,即氢键具有方向性。在抗原抗体反应中氨基或羧基
157 8.4 抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应（serologic reaction），因抗体主要存在于血清中，试 验时一般都采用血清标本，故名。但抗原抗体反应亦常用于细胞免疫测定，如对淋巴细胞表 面分化抗原的鉴定。因此，血清学一词已被广义的抗原抗体反应所取代。 抗原与抗体在体外结合时，可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种 反应，例如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等。在此基础上进行改进，又衍生出许多快速 而灵敏的抗原抗体反应，例如从凝集反应衍生出间接凝集、反向间接凝集、凝集抑制试验、 协同凝集试验等；从沉淀反应结合电泳，衍生出免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。此 外，还有各种免疫标记技术，如免疫荧光、酶免疫测定、放射免疫、免疫电镜及发光免疫测 定等。 抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发 生反应。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决 于抗体 Ig Fab 段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体不是通过共价键，而 是通过很弱的短矩引力而结合，如范德华引力（Van der waal’s attraction force）、静电引力 （electrostatic force）、氢键（hydrogen bond）及疏水性作用（hydrophobic effect）等。 范德华引力与两种相互作用的分子或原子间的距离七次方成反比（F2＝1 / d 7 )，即两者 越靠近，此引力越大。这种引力能否最大限度地发挥作用，关键在于分子的空间构型。抗原 与抗体分子的互补空间关系有助于该引力发挥作用，它可增加两种分子结合在一起的倾向， 形成特异性抗原抗体复合物。若一个分子在形态上有一个凹陷，它能准确地与另一分子突出 的基因互补，如同抗原―抗体、酶―底物系统的活性部位的相互作用，这种相互作用可产生 最强的 Van der Waal 接触。 静电引力又称库仑引力（Coulumbic attraction force）发生在带有相反电荷的基团之间， 例如 NH3 ＋与 COO－之间。这种结合力的强度与两个相互作用基团间的距离平方成反比（F2 ＝1 / d 2 )。若两个分子间有可能发生电荷转移的部位，该部位也可能产生静电引力。 氢键可在共价键结合的氢原子间产生。氢原子可与一个带负电荷的原子共价结合，再与 另一个带负电荷原子的非共价电子相互作用，就形成了氢键。例如： －O … H－O－ －O … H－N－ －N … H－N－ 氢键较弱，键能的大小取决于方向，即氢键具有方向性。在抗原抗体反应中氨基或羧基
是主要的供氢体,H必须直接对着或靠近带负电荷的受体原子,才能产生强的氢键能,若 间接对着,键能则非常小。氢键比 Van der Waal引力更特异,因为它需要分子上存在互补的 供氢体和受体基团。 疏水性结合或疏水作用在各种抗原抗体相互反应中十分重要。抗原和抗体分子上的疏水 决定簇在水中不形成氢键,因此倾向于彼此间相互吸引,而不与水发生作用,故称之为疏水 性作用。疏水性作用虽不是引力,但它有助于抗原与抗体结合。例如含有苯基的抗原决定簇 倾向于被其他非极性基团围绕,因此该抗原决定簇从水环境中移动进入抗体分子的Fab段的 裂缝中,与抗体结合。这说明结合的高能量归因于苯基的疏水性作用。 上述这些引力当pH和离子强度在生理条件下,通常是最大的。pH值低于3~4或高于 10.5,这些引力非常弱,以致抗原抗体复合物易解离。 抗原与抗体结合有高度特异性,这种结合虽具有相当稳定性,但为可逆反应。因抗原与 抗体两者为非共价键结合,犹如酶和底物的结合一样,两种分子间不形成稳定的共价键,因 此在一定条件下可以解离。 图8-3沉淀反应 The precipitin reaction ae free antibody free antigen immune complex precipitated antibody equivalenceantigen excess zone zone excess zone ntigen added
158 是主要的供氢体，H ＋必须直接对着或靠近带负电荷的受体原子，才能产生强的氢键能，若 间接对着，键能则非常小。氢键比 Van der Waal 引力更特异，因为它需要分子上存在互补的 供氢体和受体基团。 疏水性结合或疏水作用在各种抗原抗体相互反应中十分重要。抗原和抗体分子上的疏水 决定簇在水中不形成氢键，因此倾向于彼此间相互吸引，而不与水发生作用，故称之为疏水 性作用。疏水性作用虽不是引力，但它有助于抗原与抗体结合。例如含有苯基的抗原决定簇 倾向于被其他非极性基团围绕，因此该抗原决定簇从水环境中移动进入抗体分子的 Fab 段的 裂缝中，与抗体结合。这说明结合的高能量归因于苯基的疏水性作用。 上述这些引力当 pH 和离子强度在生理条件下，通常是最大的。pH 值低于 3～4 或高于 10.5，这些引力非常弱，以致抗原抗体复合物易解离。 抗原与抗体结合有高度特异性，这种结合虽具有相当稳定性，但为可逆反应。因抗原与 抗体两者为非共价键结合，犹如酶和底物的结合一样，两种分子间不形成稳定的共价键，因 此在一定条件下可以解离。 图 8-3 沉淀反应
Fig8-3 The classical illustration of the antigen-antibody reaction in vitro is the precipitin reaction. As increasing concentrations of antigen are added to a constant amount of antibody, the amount of immune complex precipitated rises and then falls. The precipitin curve generated in this way has three zones Antibody excess zone: the amount of antigen is insufficient to react with and precipitate all the antibody present; thus free antibody can be detected in the supernatant. Equivalence zone: the added antigen is sufficient to combine with and precipitate all the antibody present and neither free antigen nor antibody can be detected in the supernatant Antigen excess zone: the amount of antigen exceeds that required to bind all the antibody, and this leads to a reduction in the amount of antibody precipitated. This fall is due to the solubilization of the antigen-antibody complexes by the excess antigen. The extent to which this phenomenon occurs varies with different antibodies and with the species from hich the antibody is derived. 抗原与抗体的结合,在一定浓度范围内,只有当两者分子比例合适时,才出现可见反应 以沉淀反应为例,分子比例合适,沉淀物产生既快又多,体积大。分子比例不合适时,沉淀 物产生少,体积小,或不产生沉淀物。对参与沉淀反应的抗原一抗体系统可进行定量测定 即将抗体置于一系列的试管中,加入不同量的相应纯抗原,混合后,观察所发生的反应,对 沉淀物可作精确定量。若抗体量固定不变,抗原量逐渐增加,可观察沉淀反应中抗原、抗体 分子的比例关系。由图83可见有三个抗原抗体相互作用的区带,1)抗体过剩区( antibody excess zone):加入抗原量少,则沉淀物少,上清液中有游离的抗体( free antibody)。2)平 衡区( equivalence zone):抗原量逐渐增加,沉淀物也逐渐增多,直到抗原、抗体比例最佳 时,则出现连续而稳定的抗原一抗体晶格( lattice)沉淀,此时沉淀物中抗原抗体复合物量 最多,上清中测不到游离的抗原( free antigen)或抗体,此为平衡区或等价带。3)抗原过 剩区( antigen excess zone):抗原量继续增加,所有抗体均与抗原结合,此时上清液中可测 出游离的抗原,在此区带中,由于抗原过剩,则形成可溶性抗原抗体复合物,因而沉淀反应 部分或完全被抑制 抗体与抗原的结合是否出现可见反应,则与抗原抗体的胶体特性及极性基吸附作用有 关。抗体球蛋白和抗原(大多为蛋白质、也有为多糖、类脂或其它化合物)在溶液中均属于 胶体物质,带有电荷。胶体粒子又有许多强极性基(如蛋白质的羧基、氨基及肽链等),它 们与水有很强的亲和力,以致在粒子外周构成水层,称为亲水胶体。胶体粒子不带水层者, 称为疏水胶体。胶体粒子的稳定性即依赖于所带的水层及电荷,其中亲水胶体的稳定性较高
159 Fig8-3 The classical illustration of the antigen-antibody reaction in vitro is the precipitin reaction. As increasing concentrations of antigen are added to a constant amount of antibody, the amount of immune complex precipitated rises and then falls. The precipitin curve generated in this way has three zones: Antibody excess zone: the amount of antigen is insufficient to react with and precipitate all the antibody present; thus free antibody can be detected in the supernatant. Equivalence zone: the added antigen is sufficient to combine with and precipitate all the antibody present and neither free antigen nor antibody can be detected in the supernatant. Antigen excess zone: the amount of antigen exceeds that required to bind all the antibody, and this leads to a reduction in the amount of antibody precipitated. This fall is due to the solubilization of the antigen-antibody complexes by the excess antigen. The extent to which this phenomenon occurs varies with different antibodies and with the species from which the antibody is derived. 抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例，分子比例合适，沉淀物产生既快又多，体积大。分子比例不合适时，沉淀 物产生少，体积小，或不产生沉淀物。对参与沉淀反应的抗原―抗体系统可进行定量测定， 即将抗体置于一系列的试管中，加入不同量的相应纯抗原，混合后，观察所发生的反应，对 沉淀物可作精确定量。若抗体量固定不变，抗原量逐渐增加，可观察沉淀反应中抗原、抗体 分子的比例关系。由图 8-3 可见有三个抗原抗体相互作用的区带，1）抗体过剩区（antibody excess zone）：加入抗原量少，则沉淀物少，上清液中有游离的抗体（free antibody）。2）平 衡区（equivalence zone）：抗原量逐渐增加，沉淀物也逐渐增多，直到抗原、抗体比例最佳 时，则出现连续而稳定的抗原―抗体晶格（lattice）沉淀，此时沉淀物中抗原抗体复合物量 最多，上清中测不到游离的抗原（free antigen）或抗体，此为平衡区或等价带。3）抗原过 剩区（antigen excess zone）：抗原量继续增加，所有抗体均与抗原结合，此时上清液中可测 出游离的抗原，在此区带中，由于抗原过剩，则形成可溶性抗原抗体复合物，因而沉淀反应 部分或完全被抑制。 抗体与抗原的结合是否出现可见反应，则与抗原抗体的胶体特性及极性基吸附作用有 关。抗体球蛋白和抗原（大多为蛋白质、也有为多糖、类脂或其它化合物）在溶液中均属于 胶体物质，带有电荷。胶体粒子又有许多强极性基（如蛋白质的羧基、氨基及肽链等），它 们与水有很强的亲和力，以致在粒子外周构成水层，称为亲水胶体。胶体粒子不带水层者， 称为疏水胶体。胶体粒子的稳定性即依赖于所带的水层及电荷，其中亲水胶体的稳定性较高
抗体和大多数抗原均属于亲水胶体。 抗体球蛋白中的氨基酸在水溶液中发生电离,放出负电荷和正电荷。在一定的pH中, 胶体粒子所带的负电荷与正电荷相等,此称为等电点( isoelectric point,pl)。当溶液的pH大 于其等电点,则羧基电离,胶体粒子带负电荷。反之,当溶液pH小于其等电点时,则氨基 电离,胶体粒子带正电荷。特异性抗体与相应抗原间有相应的极性基,它们互相吸引而结合。 抗原抗体反应一般分为两个阶段,第一阶段为抗原和抗体的特异性结合,此阶段需时很 短,仅几秒到几分钟,但无可见现象出现。接着为第二阶段,即可见反应阶段,表现为凝集、 沉淀、细胞溶解等。此阶段较长,历时数分钟、数小时以致数天。此阶段反应现象的出现可 受多种因素的影响。 抗原与抗体一般为蛋白质,它们在溶液中都具有胶体性质,当溶液的pl大于它们的等 电点时,例如,在中性和弱碱性的水溶液中,它们大多表现为亲水性,且带有一定量的负电 荷。特异性抗原和抗体有相对应的极性基,抗原和抗体的特异性结合,也就是这些极性基的 相互吸附。抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性,此时易受电解质影响。如有适当浓度 的电解质存在,就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚,于是出现明显的凝聚或沉淀现象。 若无电解质存在,则不发生可见反应。 抗原抗体反应,特别是第二阶段受温度的影响很大。在较高的温度中,由于抗原抗体复 合物碰撞机会增多,复合物体积继续增大的机会也多,故反应现象加速出现。但温度过髙 (56℃以上),则抗原或抗体将变性或破坏。一般常置于37℃的恒温水浴中,使反应讯速出 合适的pH是抗原抗体反应必要的条件之一。p过高或过低可直接影响抗原和抗体的理 化性质。 8.5动物的常规免疫 由于动物的遗传性不同,同一抗原对不同的动物或同种不同品系动物,甚至不同个体, 产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此进行动物免疫时,必须选择对该抗原敏感的、年轻 的健康动物。常用的实验动物有:马、羊、兔、豚鼠和鼠等。 当抗原初次进入具有免疫应答能力的动物体内后,经过一段较长的潜伏期才出现抗体, 又经过一段高峰期后,抗体量逐渐下降至消失。这段时期总的抗体量是较低的,主要的抗体 成分是lgM,此为抗体对抗原的“初次应答“。当抗原再次进入该机体时,血清中抗体很快 出现,含量和亲和力也高于初次应答,其抗体的主要成分是IgG,此为“再次应答”。 某些物质若先于抗原或与抗原一起注入人体,可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或
160 抗体和大多数抗原均属于亲水胶体。 抗体球蛋白中的氨基酸在水溶液中发生电离，放出负电荷和正电荷。在一定的 pH 中， 胶体粒子所带的负电荷与正电荷相等，此称为等电点（isoelectric point, pI）。当溶液的 pH 大 于其等电点，则羧基电离，胶体粒子带负电荷。反之，当溶液 pH 小于其等电点时，则氨基 电离，胶体粒子带正电荷。特异性抗体与相应抗原间有相应的极性基，它们互相吸引而结合。 抗原抗体反应一般分为两个阶段，第一阶段为抗原和抗体的特异性结合，此阶段需时很 短，仅几秒到几分钟，但无可见现象出现。接着为第二阶段，即可见反应阶段，表现为凝集、 沉淀、细胞溶解等。此阶段较长，历时数分钟、数小时以致数天。此阶段反应现象的出现可 受多种因素的影响。 抗原与抗体一般为蛋白质，它们在溶液中都具有胶体性质，当溶液的 pH 大于它们的等 电点时，例如，在中性和弱碱性的水溶液中，它们大多表现为亲水性，且带有一定量的负电 荷。特异性抗原和抗体有相对应的极性基，抗原和抗体的特异性结合，也就是这些极性基的 相互吸附。抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响。如有适当浓度 的电解质存在，就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝聚或沉淀现象。 若无电解质存在，则不发生可见反应。 抗原抗体反应，特别是第二阶段受温度的影响很大。在较高的温度中，由于抗原抗体复 合物碰撞机会增多，复合物体积继续增大的机会也多，故反应现象加速出现。但温度过高 （56℃以上），则抗原或抗体将变性或破坏。一般常置于 37℃的恒温水浴中，使反应讯速出 现。 合适的 pH 是抗原抗体反应必要的条件之一。pH 过高或过低可直接影响抗原和抗体的理 化性质。 8.5 动物的常规免疫 由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同的动物或同种不同品系动物，甚至不同个体， 产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻 的健康动物。常用的实验动物有：马、羊、兔、豚鼠和鼠等。 当抗原初次进入具有免疫应答能力的动物体内后，经过一段较长的潜伏期才出现抗体， 又经过一段高峰期后，抗体量逐渐下降至消失。这段时期总的抗体量是较低的，主要的抗体 成分是 IgM，此为抗体对抗原的“初次应答“。当抗原再次进入该机体时，血清中抗体很快 出现，含量和亲和力也高于初次应答，其抗体的主要成分是 IgG，此为“再次应答”。 某些物质若先于抗原或与抗原一起注入人体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或
改变免疫应答类型,此类物质称为免疫佐剂( immunoadjuvant),简称( adjuvant)。 佐剂一般分为:1)无机佐剂,如氢氧化铝,明矾等:2)有机佐剂,包括微生物及其代 谢产物,如分枝杆菌(结核杄菌、卡介苗)、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰氏阴性杆菌 的内毒素等;3)合成佐剂,包括人工合成的双链多聚核苷酸,如双链多聚肌苷酸、胞苷酸 ( poly I: C)、双链多聚腺苷酸、尿苷酸( poly A: U)等;4)油剂,如弗氏佐剂、花生油乳化 佐剂、矿物油、植物油等。 弗氏佐剂是目前在动物实验中最常用的佐剂,可分为弗氏不完全佐剂( incomplete Freund' s adjuvant,FA)和弗氏完全佐剂( complete Freund's adjuvant,CFA)两种。前者是将 抗原和油剂(石蜡油或花生油)混合,再加入乳化剂(羊毛脂或吐温-80),使成为油包水 乳剂,即为IFA。在IFA中加入死的分枝杆菌(如灭活结核杆菌)就成为CFA。CFA作用 较弱,但易在注射部位形成肉芽肿和持久性溃疡,因而不适于人体使用。 佐剂的生物学作用为:1)增强免疫原性,使无或微弱免疫原性的物质变成有效的免疫 原;2)可提高初次应答和再次应答的抗体滴度;3)改变抗体类型,使由产生IgM转变为 产生lgG:4)引起或增强迟发型超敏反应。 动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也是不同的。淋巴结、脾脏、足掌、眼睫 膜等是反应的敏感部位,也是免疫动物的常用部位 异体蛋白在佐剂参与下,可诱发机体产生免疫应答,获得相应的抗体。如果抗原的免疫 原性很强,在基础免疫(第一次免疫)之后,加强免疫3~4次,便可获得较高效价的抗血 清( antiserum) 8.6双向免疫扩散及免疫电泳 将可溶性抗原(如小牛血清)与相应抗体(如兔抗小牛血清的抗体)混合,当两者比例 合适并有电解质(如氯化钠、磷酸盐等)存在时,即有抗原一抗体复合物的沉淀出现,此为 沉淀反应( precipitin reaction)。如以琼脂凝胶为支持介质,则在凝胶中出现可见的沉淀线 沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡,可定性、定量地检测出样品中抗原或 抗体的存在及含量。免疫学的一些测定方法即基于此特性。 双向扩散法( double diffusion),最早由 Ouchterlony创立,故又称 Ouchterlony法。此法 是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。琼脂凝胶是多孔的网状结构,大分子物质可以自由 通过,这种分子的扩散作用使分别两处的抗原和相应抗体相遇,形成抗原一抗体复合物,比 例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高,可直接观察到复合物的沉淀线(弧)。沉淀线(弧) 的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小、分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原
161 改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂（immunoadjuvant），简称（adjuvant）。 佐剂一般分为：1）无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；2）有机佐剂，包括微生物及其代 谢产物，如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗）、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰氏阴性杆菌 的内毒素等；3）合成佐剂，包括人工合成的双链多聚核苷酸，如双链多聚肌苷酸、胞苷酸 （poly I:C）、双链多聚腺苷酸、尿苷酸（poly A:U）等；4）油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化 佐剂、矿物油、植物油等。 弗氏佐剂是目前在动物实验中最常用的佐剂，可分为弗氏不完全佐剂（incomplete Freund’s adjuvant, IFA）和弗氏完全佐剂（complete Freund’s adjuvant, CFA）两种。前者是将 抗原和油剂（石蜡油或花生油）混合，再加入乳化剂（羊毛脂或吐温－80），使成为油包水 乳剂，即为 IFA。 在 IFA 中加入死的分枝杆菌（如灭活结核杆菌）就成为 CFA。CFA 作用 较弱，但易在注射部位形成肉芽肿和持久性溃疡，因而不适于人体使用。 佐剂的生物学作用为：1）增强免疫原性，使无或微弱免疫原性的物质变成有效的免疫 原；2）可提高初次应答和再次应答的抗体滴度；3）改变抗体类型，使由产生 IgM 转变为 产生 IgG；4）引起或增强迟发型超敏反应。 动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也是不同的。淋巴结、脾脏、足掌、眼睫 膜等是反应的敏感部位，也是免疫动物的常用部位。 异体蛋白在佐剂参与下，可诱发机体产生免疫应答，获得相应的抗体。如果抗原的免疫 原性很强，在基础免疫（第一次免疫）之后，加强免疫 3～4 次，便可获得较高效价的抗血 清（antiserum）。 8.6 双向免疫扩散及免疫电泳 将可溶性抗原（如小牛血清）与相应抗体（如兔抗小牛血清的抗体）混合，当两者比例 合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原―抗体复合物的沉淀出现，此为 沉淀反应（precipitin reaction）。如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、 沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或 抗体的存在及含量。免疫学的一些测定方法即基于此特性。 双向扩散法（double diffusion），最早由 Ouchterlony 创立，故又称 Ouchterlony 法。此法 是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。琼脂凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可以自由 通过，这种分子的扩散作用使分别两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原―抗体复合物，比 例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高，可直接观察到复合物的沉淀线（弧）。沉淀线（弧） 的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小、分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原
抗体存在多种系统时,会出现多条沉淀线(弧)。依据沉淀线(弧)可以定性抗原。此法操 作简便、灵敏度高,是最为常用的免疫学测定抗原和测定抗血清效价的方法(见图8-4) 图8-4免疫双向扩散法 Precipitin reactions in gels: immuno-double-diffusion dentity anti-1 b non-identity ant-1,24 c. partial identity Fig8-4 In immuno-double-diffusion, agar gels are poured onto slides and allowed te set, wells are then punched in the gel and the test solutions of antigen(Ag)and antibody (ab) are added. The solutions diffuse out and where Ag and Ab meet they bind to each other, cross-link and precipitate leaving a line of precipitation. This technique may be used to determine the relationship between antigens and a particular test antibody Three basic patterns appear. In reaction(a) the precipitin arcs formed between the antibody and the two test antigen fuse, indicating that the antibody is precipitating identical epitopes in each preparation(epitope 1). This does not mean that the antigens are necessarily identical, they are only identical in as far as the antibody cannot distinguish a difference In reaction( b) the
162 抗体存在多种系统时，会出现多条沉淀线（弧）。依据沉淀线（弧）可以定性抗原。此法操 作简便、灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和测定抗血清效价的方法（见图 8-4）。 图 8-4 免疫双向扩散法 Fig8-4 In immuno-double-diffusion, agar gels are poured onto slides and allowed to set, wells are then punched in the gel and the test solutions of antigen(Ag) and antibody(Ab) are added. The solutions diffuse out and where Ag and Ab meet they bind to each other, cross-link and precipitate leaving a line of precipitation. This technique may be used to determine the relationship between antigens and a particular test antibody. Three basic patterns appear. In reaction(a) the precipitin arcs formed between the antibody and the two test antigen fuse, indicating that the antibody is precipitating identical epitopes in each preparation(epitope 1). This does not mean that the antigens are necessarily identical, they are only identical in as far as the antibody cannot distinguish a difference. In reaction(b) the
