组织切片制备及染色技术 (一)常规石蜡切片的制备： (1)取材与固定：切取组织时应使用锋利的刀、剪，切取组织块时，从刀的根部开始 向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2-0.3cm,大小为1.5cmx1.5cmx0.3cm为宜。取 好的组织块用10%福尔马林溶液固定24-48h。 (2)包埋：先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蜡中浸透每次30mm 共3次：再包埋。 (3)切片：包埋好的石蜡块即可进行切片：切片的厚度为5um左右。 (二)苏木精-伊红(hematoxylin and on,HE)染色方法： (1)脱蜡：主要用二甲苯脱蜡。 (2)梯度乙醇水化。 (3)自来水冲洗。 (4)苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸5-20min,染细胞核。自来水冲 洗35min. (5)1%盐酸乙醇分化5-30s。自来水冲洗1-3min. (6)弱碱性水溶液返蓝30s-1min。自来水充分冲洗5~10分钟。 (7)伊红染色：充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质5~15min左右， (8)梯度乙醇脱水。 (9)二甲苯透明。 (10)中性树胶封片。 二、组织化学及免疫组织化学技术 (一)组织化学(histochemistry):一般称为特殊染色，基本原理是通过应用某些能与 组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位地显示组织细胞的特殊化学成分并保持原有 的形态学改变，对一些代谢性疾病的诊断具有一定的参考价值。通过光镜或电镜观察，可以 检测组织切片内的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等。 1.过碘酸雪夫氏染色(periodicacid-schiff stain,PAS染色)：过碘酸是一种氧化剂，它 能氧化糖类及有关物质中的12乙二醇基使之变为二醛，醛与ShiF氏试剂结合，形成红色 的取代色素而得到定位。PS染色可显示糖原、中性黏液物质、基底膜、软骨、垂体、霉茵
组织切片制备及染色技术 （一）常规石蜡切片的制备： （1）取材与固定：切取组织时应使用锋利的刀、剪，切取组织块时，从刀的根部开始 向后拉动切开组织。组织块的厚度约为 0.2~0.3cm，大小为 1.5cm x 1.5cm x 0.3cm 为宜。取 好的组织块用 10%福尔马林溶液固定 24~48h。 （2）包埋：先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蜡中浸透每次 30min， 共 3 次；再包埋。 （3）切片：包埋好的石蜡块即可进行切片；切片的厚度为 5μm 左右。 （二）苏木精－伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色方法： （1）脱蜡：主要用二甲苯脱蜡。 （2）梯度乙醇水化。 （3）自来水冲洗。 （4）苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸 5~20min，染细胞核。自来水冲 洗 3~5min。 （5）1％盐酸乙醇分化 5~30s。自来水冲洗 1~3min。 （6）弱碱性水溶液返蓝 30s~1min。自来水充分冲洗 5~10 分钟。 （7）伊红染色：充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质 5~15min 左右。 （8）梯度乙醇脱水。 （9）二甲苯透明。 （10）中性树胶封片。 二、组织化学及免疫组织化学技术 （一）组织化学（histochemistry）：一般称为特殊染色，基本原理是通过应用某些能与 组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位地显示组织细胞的特殊化学成分并保持原有 的形态学改变，对一些代谢性疾病的诊断具有一定的参考价值。通过光镜或电镜观察，可以 检测组织切片内的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等。 1.过碘酸雪夫氏染色（periodic acid-schiff stain，PAS 染色）：过碘酸是一种氧化剂，它 能氧化糖类及有关物质中的 1.2 乙二醇基使之变为二醛，醛与 Schiff 氏试剂结合，形成红色 的取代色素而得到定位。PAS 染色可显示糖原、中性黏液物质、基底膜、软骨、垂体、霉菌
及寄生虫等物质。是广泛应用的染色方法。在肾小球肾炎时PAS染色可显示基底膜和系膜 区的改变。 染色方法： (1)切片按常规脱蜡水洗，再用蒸馏水洗涤 (2)0.5%1%过碘酸水溶液氧化5-10min。 (3)蒸馏水充分洗涤，至少3次。 (4)Schiff氏试剂染10-30min (5)倾去染液后，直接用亚硫酸冲洗液处理切片3次，每次2mi,以达到分化。 (6)自来水冲洗5~10mi,使之显现出红色。然后蒸馏水洗1次。 (7)明矾苏木精染核，自来水充分洗涤。 (8)95%乙醇及无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。 结果判定：PAS阳性物质呈鲜紫红色，其它组织淡粉红色，细胞核呈浅蓝色 2结缔组织的染色方法 一般所说的结缔组织是指纤维性结缔组织而言，其结构特点是细胞间质内基质外含有较多 的纤维成分，主要是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维，我们仅简述这三种纤维的常见染色方法。 (I)Mallory三色染色法：常用于判定多种组织、器官的病变程度及修复情况，区分肿 瘤组织中的纤维成分与平滑肌。 染色步骤： ①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。 ②重铬酸钾液10min。 ③蒸馏水冲洗2min,蒸馏水2次. ④酸性复红液2min,蒸馏水稍洗 ⑤苯胺蓝液20min,95%乙醇快速分化。 ©直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 结果判定：胶原和网状纤维呈蓝色。 (2)Van Gieson苦味酸酸性复红法：可以显示组织、器官的损伤、修复及硬化情况， 特别是用于鉴别肿瘤组织中的胶原纤维与平滑肌纤维，可为诊断提供重要依据。 染色步骤： ①组织切片按常规脱蜡水洗， ②用Weigert苏木素液染细胞核50min
及寄生虫等物质。是广泛应用的染色方法。在肾小球肾炎时 PAS 染色可显示基底膜和系膜 区的改变。 染色方法： （1）切片按常规脱蜡水洗，再用蒸馏水洗涤。 （2）0.5%~1％过碘酸水溶液氧化 5~10min。 （3）蒸馏水充分洗涤，至少 3 次。 （4）Schiff 氏试剂染 10~30min。 （5）倾去染液后，直接用亚硫酸冲洗液处理切片 3 次，每次 2 min，以达到分化。 （6）自来水冲洗 5~10 min，使之显现出红色。然后蒸馏水洗 1 次。 （7）明矾苏木精染核，自来水充分洗涤。 （8）95%乙醇及无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。 结果判定：PAS 阳性物质呈鲜紫红色，其它组织淡粉红色，细胞核呈浅蓝色。 2.结缔组织的染色方法 一般所说的结缔组织是指纤维性结缔组织而言，其结构特点是细胞间质内基质外含有较多 的纤维成分，主要是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维，我们仅简述这三种纤维的常见染色方法。 （1）Mallory 三色染色法：常用于判定多种组织、器官的病变程度及修复情况，区分肿 瘤组织中的纤维成分与平滑肌。 染色步骤： ①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。 ②重铬酸钾液 10min。 ③蒸馏水冲洗 2min，蒸馏水 2 次。 ④酸性复红液 2min，蒸馏水稍洗。 ⑤苯胺蓝液 20min，95%乙醇快速分化。 ⑥直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 结果判定：胶原和网状纤维呈蓝色。 （2）Van Gieson 苦味酸酸性复红法：可以显示组织、器官的损伤、修复及硬化情况， 特别是用于鉴别肿瘤组织中的胶原纤维与平滑肌纤维，可为诊断提供重要依据。 染色步骤： ①组织切片按常规脱蜡水洗。 ②用 Weigert 苏木素液染细胞核 5~l0 min
③自来水充分洗涤数分钟。 ④用显微镜检查细胞核的若色程度，过深可用0.5%盐酸乙醇分化。 ⑤自来水洗至变蓝：用蒸馏水洗。 ⑥用Van Gieson液染l~5min. ⑦倾去染液，直接用95%乙醇分化和脱水。 ⑧无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 结果判定：胶原纤维呈深粉红色，肌纤雏、胞浆及红细胞黄色，细胞核呈棕黑色或兰 黑色。 (3)网状纤维染色一Wid染色法：可以用来显示病变组织网状支架的破坏情况。特 别是在肿瘤病理诊断中，网状纤维染色对于鉴别来源于上皮组织和间叶组织的恶性肿瘤具有 重要价值。 染色步骤： ①组织切片脱蜡至水。 ②10%磷钼酸，2-5min。蒸馏水冲洗，5min ③1%硝酸轴，5s。蒸馏水冲洗，10s ④氧化银溶液，5-10min。 ⑤95%乙醇速洗，1-2s。 ⑥还原液还原，1-2s。蒸馏水冲洗，2min ⑦0.2%氯化金调色，2-20s。蒸馏水冲洗，5min。 ⑧5%次亚硫酸钠，2min。蒸馏水冲洗，2min. ⑨核固红染细胞核，5~10min。水稍洗 ⑩常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固， 结果判定：网状纤维呈黑色、细胞核呈红色。 3.脂肪的染色方法：脂肪染色常用脂溶性色素，如苏丹Ⅲ、苏丹V、油红O等。这类染 料既能溶于有机溶剂如乙醇、丙酮内，又能溶于脂肪内。由于该类染料在脂质中溶解度较大， 染色时染料便从染液中转移到被染的脂质中去，使脂质呈染液的颜色。主要用于显示组织脏 器的脂肪变性和类脂质的异常沉着。 苏丹Ⅲ(V)染色方法： (1)冰冻切片用70%乙醇漂洗，不超过30s。 (2)切片入苏丹Ⅲ(V)染液中315mim或延长至1h
③自来水充分洗涤数分钟。 ④用显微镜检查细胞核的着色程度，过深可用 0.5%盐酸乙醇分化。 ⑤自来水洗至变蓝；用蒸馏水洗。 ⑥用 Van Gieson 液染 1~5 min。 ⑦倾去染液，直接用 95%乙醇分化和脱水。 ⑧无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 结果判定： 胶原纤维呈深粉红色，肌纤维、胞浆及红细胞黄色，细胞核呈棕黑色或兰 黑色。 （3）网状纤维染色－Wider 染色法：可以用来显示病变组织网状支架的破坏情况。特 别是在肿瘤病理诊断中，网状纤维染色对于鉴别来源于上皮组织和间叶组织的恶性肿瘤具有 重要价值。 染色步骤： ①组织切片脱蜡至水。 ②10%磷钼酸，2~5min。蒸馏水冲洗，5min。 ③1%硝酸铀，5s。蒸馏水冲洗，10s。 ④氧化银溶液，5~10min。 ⑤95%乙醇速洗，1~2s。 ⑥还原液还原，1~2s。蒸馏水冲洗，2min。 ⑦0.2%氯化金调色，2~20s。蒸馏水冲洗，5min。 ⑧5%次亚硫酸钠，2min。蒸馏水冲洗，2min。 ⑨核固红染细胞核，5~10min。水稍洗。 ⑩常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。 结果判定：网状纤维呈黑色、细胞核呈红色。 3.脂肪的染色方法：脂肪染色常用脂溶性色素，如苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、油红 O 等。这类染 料既能溶于有机溶剂如乙醇、丙酮内，又能溶于脂肪内。由于该类染料在脂质中溶解度较大， 染色时染料便从染液中转移到被染的脂质中去，使脂质呈染液的颜色。主要用于显示组织脏 器的脂肪变性和类脂质的异常沉着。 苏丹Ⅲ（Ⅳ）染色方法： （1） 冰冻切片用 70％乙醇漂洗，不超过 30s。 （2） 切片入苏丹Ⅲ（Ⅳ）染液中 3~15min 或延长至 1h
(3)新50%~70%乙醇分化，直至洗去切片上的浮色为止，蒸馏水洗。 (3)用稀释1倍的明矾苏木精浅染核1min或稍长。 (4)用滤纸将切片及周围的水分吸干。 (5)用甘油或甘油明胶封周。 结果判定：脂肪呈桔黄色或桔红色，细胞核浅蓝色。 (二)免疫组织化学(immunohistochemistry,HC):是指应用免疫学和传统的组织化学 的原理，利用抗原抗体特异性结合反应对组织、细胞中的特定抗原（或抗体）进行定位和定性 的一种染色技术。具有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结 合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽类物质的存在， 并可精确到亚细胞结构水平，利用计算机图像分析系统或激光共聚焦显微镜技术等可对被检 物质进行定量分析。标记物为荧光、酶、免疫金银及铁标记技术等。 HC可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫 表型分析、细胞增殖和凋亡的研究、激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信 号传导的研究等。 染色步骤： (1)石蜡切片脱蜡至水（放入二甲苯中脱蜡后，梯度乙醇至水化）。 (2)3%H,02室温孵育5~10min,以消除内源性过氧化物酶的活性。 (3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5mim,(如需采用抗原修复，可在此 步后进行)。 (4)5%~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵有10min。倾去血清，勿洗，滴 加适当比例稀释的第一抗体或即用型第一抗体，37℃孵有h或4C过夜。 (5)PBS冲洗，5minx3次. (6)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)或滴加生物素标记二 抗工作液，37℃或室温孵有10-30min。 (7)PBS冲洗，5minx3次. (8)谪加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)或辣根酶标记链霉卵白 素工作液，37℃或室温孵有10-30min。 (9)PBS冲洗，5minx3次. (IO)显色剂显色(DAB或AEC)
（3）新 50％~70％乙醇分化，直至洗去切片上的浮色为止，蒸馏水洗。 （3） 用稀释 1 倍的明矾苏木精浅染核 1min 或稍长。 （4） 用滤纸将切片及周围的水分吸干。 （5） 用甘油或甘油明胶封固。 结果判定：脂肪呈桔黄色或桔红色，细胞核浅蓝色。 （二）免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）：是指应用免疫学和传统的组织化学 的原理，利用抗原抗体特异性结合反应对组织、细胞中的特定抗原(或抗体)进行定位和定性 的一种染色技术。具有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结 合起来，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽类物质的存在， 并可精确到亚细胞结构水平，利用计算机图像分析系统或激光共聚焦显微镜技术等可对被检 物质进行定量分析。标记物为荧光、酶、免疫金银及铁标记技术等。 IHC 可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫 表型分析、细胞增殖和凋亡的研究、激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信 号传导的研究等。 染色步骤： （1）石蜡切片脱蜡至水（放入二甲苯中脱蜡后，梯度乙醇至水化）。 （2）3% H2O2室温孵育 5~10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （3）蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5min，(如需采用抗原修复，可在此 步后进行)。 （4）5%~10%正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10min。倾去血清，勿洗，滴 加适当比例稀释的第一抗体或即用型第一抗体，37℃孵育 1h 或 4℃过夜。 （5）PBS 冲洗，5min×3 次。 （6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释）或滴加生物素标记二 抗工作液，37℃或室温孵育 10~30min。 （7）PBS 冲洗，5min×3 次。 （8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释）或辣根酶标记链霉卵白 素工作液，37℃或室温孵育 10~30min。 （9）PBS 冲洗，5min×3 次。 （10）显色剂显色（DAB 或 AEC）
(11)自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木精复染，中性树胶封片。 结果判定：在光镜下，阳性细胞显示出棕褐色(DAB)或鲜红色(AEC)
（11）自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木精复染，中性树胶封片。 结果判定：在光镜下，阳性细胞显示出棕褐色 (DAB)或鲜红色（AEC）