细菌染色技术 一、细菌的革兰染色法 革兰染色法(Gram stain)是细南学上最经典的、使用最广泛的一种染色方法。由丹麦细菌学 家革兰(Christian Gram)于1883年创立。细菌染色后，不仅可以观察其形态，而且可根据染色结 果将细菌分为两大类，即革兰阳性菌(G+菌)和革兰阴性菌(G菌)。 1、原理： (1)G菌细胞壁结构致密（肽聚糖层厚），且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色：G菌细胞壁结 构疏松（肚聚糖层薄），且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色 (2)G菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢周结合，使已者色的细菌不被乙醇 脱色。G菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。 (3)G菌等电点比G菌低，在同一pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多，故与带正电荷 的碱性染料结品紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。 2、应用 革兰染色法的实际应用意义有三： (1)按照革兰染色法可把细菌分为G和G两大类： (2G菌和G菌的致病性不同，所致疾病各异： (3)对G和G菌，选择不同抗菌物治疗。 3、材料 (1)葡萄球茵和大肠埃希菌培养18一24h后的混合菌液 (2)兰染色液：结品紫染液、碘液、95%酒精、稀释复红或沙黄染液。 (仔)授玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、显微镜等。 4、方法 标本片制备 (1)载玻片准备：取一张清洁载玻片，用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、直径约1一2cm 的涂抹范围，用数字或符号做好标记。 (2)涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内。接种 环在火焰上烧灼灭南
细菌染色技术 一、细菌的革兰染色法 革兰染色法(Gram stain)是细菌学上最经典的、使用最广泛的一种染色方法。由丹麦细菌学 家革兰(Christian Gram)于 1883 年创立。细菌染色后，不仅可以观察其形态，而且可根据染色结 果将细菌分为两大类，即革兰阳性菌(G+菌)和革兰阴性菌(G- 菌)。 1、原理： (1)G+ 菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚)，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色；G- 菌细胞壁结 构疏松(肽聚糖层薄)，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。 (2)G+ 菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇 脱色。G- 菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。 (3)G+ 菌等电点比G- 菌低，在同一pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多，故与带正电荷 的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。 2、应用 革兰染色法的实际应用意义有三： (1)按照革兰染色法可把细菌分为G+ 和G- 两大类； (2)G+ 菌和G- 菌的致病性不同，所致疾病各异； (3)对G+ 和G- 菌，选择不同抗菌物治疗。 3、材料 (1)葡萄球菌和大肠埃希菌培养 18～24h 后的混合菌液。 (2)兰染色液：结晶紫染液、碘液、95%酒精、稀释复红或沙黄染液。 (3)载玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、显微镜等。 4、方法 标本片制备 (1)载玻片准备：取一张清洁载玻片，用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、直径约 1～2cm 的涂抹范围，用数字或符号做好标记。 (2)涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内。接种 环在火焰上烧灼灭菌
()干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于离酒精灯火焰约半尺高处缓 慢烘干，切不可放在火焰上烧干。 (4)固定：将干燥后的涂片用片夹夹住，使涂抹面向上缓慢通过火焰3次，然后自然冷却。 固定即可杀死细菌，并使细菌固者于玻片上，以免染色时脱落；又可使细菌蛋白凝固，而易 色。 革兰染色法： (1)初染：在因定好并冷却了的涂片上滴加结晶紫染液1~2滴，作用1mi后，用细水流从 玻片的一端把游离的染液洗去 (2煤染：滴加卢(Lugol)碘液数滴，作用1mm后水洗。碘液是媒染剂，使结晶紫染液与 细南结合更牢固。 ()脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻晃动玻片，使玻片上流下的酒精液无紫色为止（约需0.5~ min,流水冲洗。 (4)复染：滴加稀释复红（或沙黄）染液数滴，作用1mi后流水冲洗。最后用吸水纸印干标本 片或自然干燥后，玻片上滴加香柏油，用油镜观察。 5、结果 G南染成紫色：G南染成红色。 6、影响因素 ()操作因素：涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时避免菌体过份 受热。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。 (②)细菌因素：不同时间培养物，革兰染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老 龄菌被染成红色。细菌染色时最好用18~24h的细菌培养物。 (3)染液因素：所有染色液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后 易失去媒染作用。脱色酒精以95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使酒精浓度 下降而减弱其脱色能力. 二、细菌荚膜染色法Hss法) 1、原理与应用 细菌荚膜是细菌细胞壁外面的一层粘液性物质。其对染料的亲和力弱，不易着色，通常采 用负染色法染色，即使菌体和背景者色而荚膜不若色。因此在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜 含水量在90%以上，染色时一般不用热固定，以防荚膜皱缩变形。荚膜染色法用于有荚膜细菌
(3)干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于离酒精灯火焰约半尺高处缓 慢烘干，切不可放在火焰上烧干。 (4)固定：将干燥后的涂片用片夹夹住，使涂抹面向上缓慢通过火焰 3 次，然后自然冷却。 固定即可杀死细菌，并使细菌固着于玻片上，以免染色时脱落；又可使细菌蛋白凝固，而易着 色。 革兰染色法： (1)初染：在固定好并冷却了的涂片上滴加结晶紫染液 1～2 滴，作用 1min 后，用细水流从 玻片的一端把游离的染液洗去。 (2)媒染：滴加卢戈(Lugol)碘液数滴，作用 1min 后水洗。碘液是媒染剂，使结晶紫染液与 细菌结合更牢固。 (3)脱色：滴加 95%酒精数滴，轻轻晃动玻片，使玻片上流下的酒精液无紫色为止(约需 0.5～ 1min)，流水冲洗。 (4)复染：滴加稀释复红(或沙黄)染液数滴，作用 1min 后流水冲洗。最后用吸水纸印干标本 片或自然干燥后，玻片上滴加香柏油，用油镜观察。 5、结果 G+ 菌染成紫色；G- 菌染成红色。 6、影响因素 ⑴操作因素：涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时避免菌体过份 受热。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。 ⑵细菌因素：不同时间培养物，革兰染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老 龄菌被染成红色。细菌染色时最好用 18～24h 的细菌培养物。 ⑶染液因素：所有染色液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后 易失去媒染作用。脱色酒精以 95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使酒精浓度 下降而减弱其脱色能力。 二、细菌荚膜染色法(Hiss 法) 1、原理与应用 细菌荚膜是细菌细胞壁外面的一层粘液性物质。其对染料的亲和力弱，不易着色，通常采 用负染色法染色，即使菌体和背景着色而荚膜不着色。因此在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜 含水量在 90%以上，染色时一般不用热固定，以防荚膜皱缩变形。荚膜染色法用于有荚膜细菌
如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌及产气荚膜梭菌的鉴定。 2、材料 (1)荚膜菌液 (2)结晶紫酒精饱和液5ml,加蒸馏水95ml混合液 (3200gL硫酸铜水溶液 3、方法 将荚膜菌涂片，在空气中自然干燥，不需加热周定。滴加结晶紫染色液，在火焰上微微加 热，使玻片上染液冒蒸汽为止，不要水洗，再用200gL硫酸铜水溶液冲洗染液，切勿用流水冲 洗。用吸水纸吸干后油镜观察。 4、结果 细茵茵体呈紫色，荚膜呈淡紫色或无色， 三、细菌鞭毛染色法 1、原理与应用 细菌粮毛为细菌的运动器官。其形态细长，直径约10~20m,需用电子显微镜才能观察到。 若用特殊染色使鞭毛增粗并若色，则在普通光学显微镜下也可观察到。鞭毛染色方法很多，但 原理基本类似，即在染色前先经媒染剂处理，使鞭毛增粗，然后再进行染色。 2、材料 ()变形杆菌6一8h血琼脂平板培养物。 (2)染色液， A液：200gL钾明矾液（加温溶解20ml,50gL石炭酸液50ml,200gL鞣酸液（加温溶 解)20ml。 B液：复红酒精饱和液。 取A液9份和B液1份混合后立即过滤。滤液放置6h后，使用最佳。 (3)蒸馏水管 3、方法 (1)细菌标本制备：取变形杆菌血琼脂平板培养物，仔细从菌膜伸展最远处挑取菌少许，轻轻 放入蒸馏水管中，经数min使其自行分散，再37C25~30min。 (2)涂片：取上述菌液一接种环，轻轻滴于载玻片上，使成薄膜。涂抹时接种环随水滴移动， 切勿与玻片相磨，以免鞭毛脱落
如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌及产气荚膜梭菌的鉴定。 2、材料 ⑴荚膜菌液 ⑵结晶紫酒精饱和液 5ml，加蒸馏水 95ml 混合液。 ⑶200g/L 硫酸铜水溶液。 3、方法 将荚膜菌涂片，在空气中自然干燥，不需加热固定。滴加结晶紫染色液，在火焰上微微加 热，使玻片上染液冒蒸汽为止，不要水洗，再用 200g/L 硫酸铜水溶液冲洗染液，切勿用流水冲 洗。用吸水纸吸干后油镜观察。 4、结果 细菌菌体呈紫色，荚膜呈淡紫色或无色。 三、细菌鞭毛染色法 1、原理与应用 细菌鞭毛为细菌的运动器官。其形态细长，直径约 10～20nm，需用电子显微镜才能观察到。 若用特殊染色使鞭毛增粗并着色，则在普通光学显微镜下也可观察到。鞭毛染色方法很多，但 原理基本类似，即在染色前先经媒染剂处理，使鞭毛增粗，然后再进行染色。 2、材料 (1)变形杆菌 6～8h 血琼脂平板培养物。 (2)染色液。 A 液：200g/L 钾明矾液(加温溶解)20ml，50g/L 石炭酸液 50ml，200g/L 鞣酸液(加温溶 解)20ml。 B 液：复红酒精饱和液。 取 A 液 9 份和 B 液 1 份混合后立即过滤。滤液放置 6h 后，使用最佳。 （3）蒸馏水管 3、方法 (1)细菌标本制备：取变形杆菌血琼脂平板培养物，仔细从菌膜伸展最远处挑取菌少许，轻轻 放入蒸馏水管中，经数 min 使其自行分散，再 37 25 ℃ ～30min。 (2)涂片：取上述菌液一接种环，轻轻滴于载玻片上，使成薄膜。涂抹时接种环随水滴移动， 切勿与玻片相磨，以免鞭毛脱落
(仔)染色：涂片自然干巢勿用火焰周定)后，加染色液作用1~2min,水洗、吸干、镜检 4、结果 鞭毛呈淡红色，菌体呈红色。 四、细菌芽胞染色法 1、原理与应用 芽胞具有高度的折光性，外膜致密，渗透性低，故普通染色法不易使其着色，芽胞染色法 是根据芽胞既难以者色，而一旦着色又难以脱色的特点设计的。所有芽胞染色法都基于同一个 原则：采用着色力强的染料，并加热以促进标本者色，然后使南体脱色，而芽胞上的染料仍保 留，经复染后，茵体和芽胞呈现不同的颜色。 2、材料 (1)破伤风梭茵48~72培养物 (2石炭酸复红液、碱性美兰液、95%酒精 3、方法 ()将破伤风梭茵培养物涂片，自然干燥，火焰固定，滴加石炭酸复红液，并加温至产生蒸 汽（不可煮沸）鈞5min,防止染液干调，随时补充，待载玻片冷却后，水洗。 (2)用95%酒精脱色2min,水洗。 (3)滴加美兰染液复染30s©c,水洗，待干，镜检。 4、结果 芽胞呈红色，菌体呈蓝色。 五、抗酸染色法 1、原理与应用 结核分枝杆菌对苯胺染料一般不易着色，若加温或延长染色时间使其色后，再用3%盐酸 酒精处理也不易脱色，经此染色后，结核分枝杆菌及其他分枝杆菌呈红色，而非抗酸菌和细胞 杂质等呈蓝色。 2、材料 ()结核病人痰 (2抗酸染色液 ()玻片、片夹、滤纸片、竹签、空平皿、污物盆
(3)染色：涂片自然干燥(勿用火焰固定)后，加染色液作用 1～2min ，水洗、吸干、镜检。 4、结果 鞭毛呈淡红色，菌体呈红色。 四、细菌芽胞染色法 1、原理与应用 芽胞具有高度的折光性，外膜致密，渗透性低，故普通染色法不易使其着色，芽胞染色法 是根据芽胞既难以着色，而一旦着色又难以脱色的特点设计的。所有芽胞染色法都基于同一个 原则：采用着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保 留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。 2、材料 (1)破伤风梭菌 48～72h 培养物 (2)石炭酸复红液、碱性美兰液、95%酒精 3、方法 (1)将破伤风梭菌培养物涂片，自然干燥，火焰固定，滴加石炭酸复红液，并加温至产生蒸 汽(不可煮沸)约 5min，防止染液干涸，随时补充，待载玻片冷却后，水洗。 (2)用 95%酒精脱色 2min，水洗。 (3)滴加美兰染液复染 30sec，水 洗，待干，镜检。 4、结果 芽胞呈红色，菌体呈蓝色。 五、抗酸染色法 1、原理与应用 结核分枝杆菌对苯胺染料一般不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用 3%盐酸 酒精处理也不易脱色，经此染色后，结核分枝杆菌及其他分枝杆菌呈红色，而非抗酸菌和细胞 杂质等呈蓝色。 2、材料 (1)结核病人痰 (2)抗酸染色液 (3)玻片、片夹、滤纸片、竹签、空平皿、污物盆
3、方法 (1)取洁净的竹签沾取痰中血丝或脓性痰，在清洁无油脂玻片上涂开。涂抹区约拇指盖大。 用过的竹签放到空平皿内待高压灭菌。 (2)涂片自然干燥后，用片夹找住玻片一端，通过火焰固定。 (③)涂抹面用滤纸片盖上，然后往滤纸片上滴加石炭酸复红染液，使滤纸片完全被染液浸湿 持玻片在小火上加温片刻然后离开火焰，此时可见到玻片上目出蒸气。待蒸气消失后再加温， 如此反复3~4次，约5mn,加温时随时添加染液勿使纸片干涸。 (4)玻片冷却后，用接种环挑去滤纸扔到污物盆内，流水冲洗玻片。 (⑤)滴加3%盐酸酒精脱色，至涂抹均匀部位基本没有红色再脱下为止，水洗。 (6)滴加吕氏美蓝染液30sc,水洗。 (7)吸干、镜检。 4、溶液配制 萋-尼(Zichl-Neelsen))抗酸染色液 (1)石炭酸复红液：险性复红4g,溶于95%酒精100ml,作成饱和溶液，再取该饱和液10ml 与5%石炭酸溶液90ml混匀即成。 (2)3%盐酸酒精液。 浓盐酸3ml加入95%酒精97ml中即成。 ()沿Loeffer)氏美蓝染色液 美蓝2g,溶于95%酒精100ml中，作成饱和液。再取该饱和液30ml与0.01%氢氧化钾水 溶液100ml混合均匀即可。 大、奈瑟染色法 1、材料 (1)染液甲 第一液：美兰1g,95%酒精30ml,冰醋酸50ml,蒸馏水100ml。 第二液：结晶紫1g,95%酒精10ml,蒸馏水300ml 以上第一液二份，与第二液一份混合之。 (2)染液乙，黄叱精1或2g,热蒸馏水300ml,待溶解后过滤。. 2、染色法
3、方法 (1)取洁净的竹签沾取痰中血丝或脓性痰，在清洁无油脂玻片上涂开。涂抹区约拇指盖大。 用过的竹签放到空平皿内待高压灭菌。 (2)涂片自然干燥后，用片夹挟住玻片一端，通过火焰固定。 (3)涂抹面用滤纸片盖上，然后往滤纸片上滴加石炭酸复红染液，使滤纸片完全被染液浸湿， 持玻片在小火上加温片刻然后离开火焰，此时可见到玻片上冒出蒸气。待蒸气消失后再加温， 如此反复 3～4 次，约 5min，加温时随时添加染液勿使纸片干涸。 (4)玻片冷却后，用接种环挑去滤纸扔到污物盆内，流水冲洗玻片。 (5)滴加 3%盐酸酒精脱色，至涂抹均匀部位基本没有红色再脱下为止，水洗。 (6)滴加吕氏美蓝染液 30sec，水洗。 (7)吸干、镜检。 4、溶液配制 萋－尼(Zichl-Neelsen)抗酸染色液 (1)石炭酸复红液：硷性复红 4g，溶于 95%酒精 100ml，作成饱和溶液，再取该饱和液 10ml 与 5%石炭酸溶液 90ml 混匀即成。 (2)3%盐酸酒精液。 浓盐酸 3ml 加入 95%酒精 97ml 中即成。 (3)吕(Loeffer)氏美蓝染色液 美蓝 2g，溶于 95%酒精 100ml 中，作成饱和液。再取该饱和液 30ml 与 0.01%氢氧化钾水 溶液 100ml 混合均匀即可。 六、奈瑟染色法 1、材料 (1)染液甲 第一液：美兰 1g，95%酒精 30ml，冰醋酸 50ml，蒸馏水 100ml。 第二液：结晶紫 1g, 95%酒精 10ml, 蒸馏水 300ml。 以上第一液二份，与第二液一份混合之。 (2)染液乙，黄叱精 1 或 2g，热蒸馏水 300ml，待溶解后过滤。 2、染色法
(1)涂片按常规法固定后，滴加奈瑟染液甲液数滴于涂片上，15~30S©c,水洗 (2)用奈瑟染液乙液复染10~30秒钟。 )迅速用水洗，吸干、镜检。 3、结果 菌体呈鲜明黄色、异染颗粒呈深紫兰色
(1)涂片按常规法固定后，滴加奈瑟染液甲液数滴于涂片上，15～30 Sec，水洗。 (2)用奈瑟染液乙液复染 10～30 秒钟。 (3)迅速用水洗，吸干、镜检。 3、结果 菌体呈鲜明黄色、异染颗粒呈深紫兰色