细菌的分离培养技术 一、常用培养基的制各 (一)肉音汤培养基(broth medium) 1、成分牛肉浸音3~5g蛋白陈10g氯化钠5g蒸馏水1000ml 2、制法 (1)于1000ml蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。 (2)调整plH为7.4~7.6，煮沸3~5min,用滤纸过滤。 (③)分装于适当容器内，高压灭菌10343Kp20min,置阴暗处或冰箱中贮存备用。 3、用途供一般细茵培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。 (二)肉浸汤培养基(infusion medium) 1、成分 (1)新鲜牛肉（去脂绞碎）500g蛋白胨10g (2氯化钠5g蒸馏水1000ml 2、法 ()取新鲜牛肉（兔肉）除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机纹碎或用刀剁碎，置于 糖瓷或铝制锅中，每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中过夜。 (2)次日取出肉浸液，搅拌均匀，煮沸30min并常搅拌以免沉淀烧焦。如蛋白质已凝周， 即停止加温，补足失去水分。 (③)用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。 (4在滤液中加入蛋白胨(10gL小、氯化钠5gL),再加热使其全部溶解。 (⑤)调整pH至7.6~7.8，煮沸10min,以滤纸过滤。 (⑥)分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌103.43KPa20min,冷却 后置阴暗或冰箱中保存备用。 3、用途 供作基础培养基用，营养较肉音汤好。一般营养要求不高的细菌均能生长。 (三)普通琼脂培养(agar medium) 1、成分
细菌的分离培养技术 一、常用培养基的制备 （一）肉膏汤培养基 (broth medium) 1、成分 牛肉浸膏 3～5g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000ml 2、制法 (1) 于 1000ml 蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。 (2) 调整 pH 为 7.4～7.6，煮沸 3～5min，用滤纸过滤。 (3) 分装于适当容器内，高压灭菌 103.43Kpa 20min ,置阴暗处或冰箱中贮存备用。 3、用途 供一般细菌培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。 （二）肉浸汤培养基(infusion medium) 1、成分 ⑴新鲜牛肉(去脂绞碎)500g 蛋白胨 10g ⑵氯化钠 5g 蒸馏水 1000ml 2、制法 (1) 取新鲜牛肉(兔肉)除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎或用刀剁碎，置于 糖瓷或铝制锅中，每 500g 碎肉加水 1000ml 混合后置冰箱中过夜。 (2) 次日取出肉浸液，搅拌均 匀，煮沸 30min 并常搅拌以免沉淀烧焦。如蛋白质已凝固， 即停止加温，补足失去水分。 (3) 用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。 (4) 在滤液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化钠(5g/L)，再加热使其全部溶解。 (5) 调整 pH 至 7.6～7.8，煮沸 10min，以滤纸过滤。 (6) 分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌 103.43KPa 20min，冷却 后置阴暗或冰箱中保存备用。 3、用途 供作基础培养基用，营养较肉膏汤好。一般营养要求不高的细菌均能生长。 （三）普通琼 脂培养基(agar medium) 1、成分
牛肉浸膏3~5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20~25g 蒸馏水1000ml 2、制法 ()将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。 (2)老热调整pH至7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌103.43KPa15min。 (③)琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭南的试管内， 斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。 琼脂平板培养基制法：经高压灭南后的培养基冷却至50一55℃时，打开瓶口棉塞，将琼 脂倒入己灭菌的平皿内（直径9cm的平皿约需培养基20m),待凝固后即成琼脂平板培养基。平 板培养基制成后，通常都是倒置的，这种放置既便于取放，又有利于避免水分蒸发，以及保持 无菌状态。普通琼指培养基亦可用市售的营养球脂粉制备。取4.5g营养琼脂粉加蒸馏水100ml 高压燕汽灭菌后倾注平皿即成。 3、用途供一般细茵培养用，并可作无糖培养基。 (四)半固体琼脂培养基soft agar medium) 1、成分 ()牛肉浸液（或牛肉音汤）100ml (2)琼脂025~0.5g 2、制法 (1)将琼脂加于肉浸液中，加热溶化， (②)以绒布过滤并分装试管，每管约1一1.5ml。 (3)高压灭菌103.43KP%20min后，直立放置，待凝固后即成高层培养基，保存备用。 3、用途保存一般菌种用，并可观察细菌的动力。 (五)血液琼脂培养基blood agar medium) 1、配方一： (1)成分： ①普通琼脂培养基100ml ②脱纤维羊血（兔血）8~10ml (2)制法 ①将高压灭南后的普通琼脂培养热(pH7.6)加热融化
牛肉浸膏 3～5g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 20～25g 蒸馏水 1000ml 2、制法 ⑴将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解(须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。 ⑵趁热调整 pH 至 7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌 103.43KPa 15min。 ⑶琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭菌的试管内， 斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。 琼脂平板培养基制法：经高压灭菌后的培养基冷却至 50～55℃时，打开瓶口棉塞，将琼 脂倒入已灭菌的平皿内(直径 9cm 的平皿约需培养基 20ml)，待凝固后即成琼脂平板培养基。平 板培养基制成后，通常都是倒置的，这种放置既便于取放，又有利于避免水分蒸发，以及保持 无菌状态。普通琼指培养基亦可用市售的营养琼脂粉制备。取 4.5g 营养琼脂粉加蒸馏水 100ml， 高压蒸汽灭菌后倾注平皿即成。 3、用途 供一般细菌培养用，并可作无糖培养基。 （四）半固体琼脂培养基(soft agar medium) 1、成分 ⑴牛肉浸液(或牛肉膏汤)100ml ⑵琼脂 0.25～0.5g 2、制法 ⑴将琼脂加于肉 浸液中，加热溶化。 ⑵以绒布过滤并分装试管，每管约 1～1.5ml。 ⑶高压灭菌 103.43KPa 20min 后，直立放置，待凝固后即成高层培养基，保存备用。 3、用途 保存一般菌种用，并可观察细菌的动力。 （五）血液琼脂培养基(blood agar medium) 1、配方一： ⑴成分： ①普通琼脂培养基 100ml ②脱纤维羊血(兔血)8～10ml ⑵制法 ①将高压灭菌后的普通琼脂培养基(pH7.6)加热融化
②冷至50℃左右，以无菌操作加入无菌脱纤维羊血（临用前置37℃水箱中预温30min)8 10m,轻轻摇匀（防止产生气泡），倾注于灭菌平皿内或分装试管内，制成血琼脂平板或血 琼脂斜面培养基。 ③待凝固后，抽样于37℃培养18~24h行无茵试验，若培养基上无细菌生长即可使用或保 存于4℃冰箱内备用。 (③)用途供分离营养要求较高的病原菌用。 2、配方二： ()成分 牛肉青(plH7.8)800ml 硫酸镁(493gL)8ml 脱纤维羊血80ml 琼脂21~23g 5g/L对氨基苯甲酸8ml (2)制法 ①将肉膏汤置于三角烧瓶内，加入硫酸镁、对氨基苯甲酸及琼脂，混合并使液体浸湿琼脂。 ②加热溶解，或置于103.43kPa高压灭菌器内30mim(可达融化与灭菌的目的) ③取出后冷至50℃左右，以无茵操作加入无南脱纤维羊血或兔血，轻轻摇匀，倾注平板， 凝固后，抽样经37℃培养18一24h,如无细茵生长，冷藏备用。 (③)用途：供已使用过抗生素及磺胺药的病人标本分离培养。 (六)SS琼脂培养基(Salmonella-Shigellamedium) 1、成分 这是一种选择性培养基，SS琼脂培养基配方较多，其基本原理一致。 2、制法 ()将牛肉膏、蛋白胨和琼脂加入水中，加热溶解。 (②加入胆盐、乳糖、柠檬酸钠及柠檬酸铁，微微加热，使之全部溶解。 (3)调整pH至72后，用绒布或脱脂棉过滤。 (④)加入煌绿和中性红水溶液，再煮沸一次（无需高压灭南），待冷至55℃左右倾注平板，凝 周后将平板置37℃温箱中干燥30min后应用或冰箱保存备用.。 3、用途供分离培养肠道致病菌用
②冷至 50℃左右，以无菌操作加入无菌脱纤维羊血(临用前置 37℃水箱中预温 30min)8～ 10ml，轻轻摇匀(防止产生气泡)，倾注于灭菌平皿内或分装试管内，制成血琼脂平板或血 琼脂斜面培养基。 ③待凝固后，抽样于 37℃培养 18～24h 行无菌试验，若培养基上无细菌生长即可使用或保 存于 4℃冰箱内备用。 ⑶用途 供分离营养要求较高的病原菌用。 2、配方二： ⑴成分 牛肉膏(pH7.8)800ml 硫酸镁(493g/L)8ml 脱纤维羊血 80ml 琼脂 21～23g 5g/L 对氨基苯甲酸 8ml ⑵制法 ①将肉膏汤置于三角烧瓶内，加入硫酸镁、对氨基苯甲酸及琼脂，混合并使液体浸湿琼脂。 ②加热溶解，或置于 103.43kPa 高压灭菌器内 30min(可达融化与灭菌的目的)。 ③取出后冷至 50℃左右，以无菌操作加入无菌脱纤维羊血或兔血，轻轻摇匀，倾注平板， 凝固后，抽样经 37℃培养 18～24h，如无细菌生长，冷藏备用。 ⑶用途：供已使用过抗生素及磺胺药的病人标本分离培养。 （六）SS 琼脂培养基(Salmonella-Shigella medium) 1、成分 这是一种选择性培养基，SS 琼脂培养基配方较多，其基本原理一致。 2、制法 ⑴将牛肉膏、蛋白胨和琼脂加入水中，加热溶解。 ⑵加入胆盐、乳糖、柠檬酸钠及柠檬酸铁，微微加热，使之全部溶解。 ⑶调整 pH 至 7.2 后，用绒布或脱脂棉过滤。 ⑷加入煌绿和中性红水溶液，再煮沸一次(无需高压灭菌)，待冷至 55℃左右倾注平板，凝 固后将平板置 37℃温箱中干燥 30min 后应用或冰箱保存备用。 3、用途 供分离培养肠道致病菌用
(七)吕氏血清斜面培养基Loeffler medium) 1、成分 ()10gL葡萄糖肉浸液100ml (2动物血清（马、牛、羊等）300m 2、制法 ()用pH7.4肉浸液100ml,加入1g葡萄糖，溶解后与动物血清混合，分装于中试管内，每 管45ml。 (2②)放于血清凝固器内制成斜面，加热至80℃并维持30mi,待血清充分凝固，但加热不能 过高过快，否则其表面易产生气泡。于第二d和第三d继用85℃灭菌1h. (3)制成后进行无南试验。 3、用途供分离培养白喉杆菌用。 二、细菌培养技术 (一)平板划线分离培养法 1、原理与应用 通过划线，将混杂的细菌在平板表面逐一分敢，经培养后，各自形城菌落(cooy)。根据菌 落形态、特征挑选单个菌落，移种培养后，即得到纯种细南。 2、材料 琼脂平板培养基简称普通平板)。 含菌标本如脓汁、粪便与分泌物等)， 3、方法 操作前先在盛培养基的平皿底上注明检查标本的名称（或编号）、接种日期及检查者的组别与 代号。 平板划线法有几儿种，可根据不同情况选用其中一种。 (1)平行划线法。（见图20-1）此法适用于含菌不多的液体标本，如脑脊液(CSF)、腹水、分 泌物、脓汁以及稀薄的菌液等。 ①左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本 先在平板的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线，约占平板面积的一半。 ②将平板转180°角，从平板另一端开始也划密集的平行线，直到划满平板的剩余部分。 将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平板倒置，37℃培养
（七）吕氏血清斜面培养基(Loeffler medium) 1、成分 ⑴10g/L 葡萄糖肉浸液 100ml ⑵动物血清(马、牛、羊等)300ml 2、制法 ⑴用 pH7.4 肉浸液 100ml，加入 1g 葡萄糖，溶解后与动物血清混合，分装于中试管内，每 管 4～5ml。 ⑵放于血清凝固器内制成斜面，加热至 80℃并维持 30min，待血清充分凝固，但加热不能 过高过快，否则其表面易产生气泡。于第二 d 和第三 d 继用 85℃灭菌 1h。 ⑶制成后进行无菌试验。 3、用途 供分离培养白喉杆菌用。 二、细菌培养技术 （一）平板划线分离培养法 1、原理与应用 通过划线，将混杂的细菌在平板表面逐一分散，经培养后，各自形成菌落(colony)。根据菌 落形态、特征挑选单个菌落，移种培养后，即得到纯种细菌。 2、材料 琼脂平板培养基(简称普通平板)。 含菌标本(如脓汁、粪便与分泌物等)。 3、方法 操作前先在盛培养基的平皿底上注明检查标本的名称(或编号)、接种日期及检查者的组别与 代号。 平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。 (1)平行划线法。（见图 20-1）此法适用于含菌不多的液体标本，如脑脊液(CSF)、腹水、分 泌物、脓汁以及稀薄的菌液等。 ①左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本， 先在平板的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线，约占平板面积的一半。 ②将平板转 180°角，从平板另一端开始也划密集的平行线，直到划满平板的剩余部分。 将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平板倒置，37℃培养
(2)分区划线法。（见图20-2）此法适用于含茵多的检测标本，如粪便，喀痰、细菌固体培养 物等。 ①划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标本涂开并在平板的1/5~14面积上划 密集的平行线，接种环火焰灭菌。 ②将平板转约70°角，待接种环冷却后，使接种环通过已划线的1区5~7次，以后即不与 1区接触作连续密集划线，约占平板面积的14，接种环再通过火焰灭菌。 ③再转平板约70°，如上法在第3区划线，此后接种环不再灭菌。 ④重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表面。将平板底放入盖内，接种环灭菌 后放下，置37℃培养。 4、结果 (1)培养后在第1、2区可观察到密集的细菌菌苔。 (2)在第3、4区可见单个细菌菌落（在划线上）。 (二)纯种细菌移种技术 1、斜面培养基移种技术 (1材料 琼脂斜面培养基 经分离培养的平板培养物。 (2)方法 ①在琼脂斜面培养基试管上部标明移种的菌名（或编号）、接种日期、接种者的组别及代号。 ②左手持长有细菌的平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌冷却后，沾取平板划线 上发有良好的孤立南落。把平板放回原处，立即用此手取斜面培养基斜持，用右手小指与手掌 夹持棉塞，轻轻转动后拨出棉塞，管口通过火焰灭茵。 ③将己沾菌的接种环伸入斜面培养基的管底部的凝固水，沿斜面培养基的表面从底向上划 一直线，然后再从底部向上划连续曲折线；也可不划直线只划曲折线。取出接种环，管口通过 火焰灭菌，塞好棉塞，放试管架上，接种环火焰灭南后放下。 向斜面培养基上移种的细茵如果是生长在斜面培养基上的，或是生长在液体培养基中的， 则用左手同时斜持南种管和斜面培养基两个管，右手无名指、小指手掌同时拔起夹持二个棉塞。 管口及接种环先经火焰灭茵后，从菌种管取菌立即移种到斜面上，塞好棉塞，接种环火焰灭菌 后放下（见图20-4）。然后将斜面培养基放37℃恒温箱中培养24h。3、结果斜面表面形成南苔
(2)分区划线法。(见图 20-2)此法适用于含菌多的检测标本，如粪便，喀痰、细菌固体培养 物等。 ①划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标本涂开并在平板的 1/5～1/4 面积上划 密集的平行线，接种环火焰灭菌。 ②将平板转约 70°角，待接种环冷却后，使接种环通过已划线的 1 区 5～7 次，以后即不与 1 区接触作连续密集划线，约占平板面积的 1/4，接种环再通过火焰灭菌。 ③再转平板约 70°，如上法在第 3 区划线，此后接种环不再灭菌。 ④重复上述操作在第 4 区划线，划满余下的培养基表面。将平板底放入盖内，接种环灭菌 后放下，置 37℃培养。 4、结果 (1)培养后在第 1、2 区可观察到密集的细菌菌苔。 (2)在第 3、4 区可见单个细菌菌落(在划线上)。 （二）纯种细菌移种技术 1、斜面培养基移种技术 (1)材料 琼脂斜面培养基 经分离培养的平板培养物。 (2)方法 ①在琼脂斜面培养基试管上部标明移种的菌名(或编号)、接种日期、接种者的组别及代号。 ②左手持长有细菌的平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌冷却后，沾取平板划线 上发育良好的孤立菌落。把平板放回原处，立即用此手取斜面培养基斜持，用右手小指与手掌 夹持棉塞，轻轻转动后拨出棉塞，管口通过火焰灭菌。 ③将已沾菌的接种环伸入斜面培养基的管底部的凝固水，沿斜面培养基的表面从底向上划 一直线，然后再从底部向上划连续曲折线；也可不划直线只划曲折线。取出接种环，管口通过 火焰灭菌，塞好棉塞，放试管架上，接种环火焰灭菌后放下。 向斜面培养基上移种的细菌如果是生长在斜面培养基上的，或是生长在液体培养基中的， 则用左手同时斜持菌种管和斜面培养基两个管，右手无名指、小指手掌同时拔起夹持二个棉塞。 管口及接种环先经火焰灭菌后，从菌种管取菌立即移种到斜面上，塞好棉塞，接种环火焰灭菌 后放下（见图 20-4）。然后将斜面培养基放 37℃恒温箱中培养 24h。3、结果斜面表面形成菌苔
2、液体培养基移种技术 用于纯种细菌的增菌及观察细菌在液体环境中的生长特征（混浊生长，表面生长或沉淀生长） (1)材料 肉汤培养基 斜面培养物（大肠埃希茵、化脓性链球菌、枯草芽胞杆菌 2)方法 ①取接种环在火焰上灼烧灭菌、冷却。 ②以“双管移植法”左手持细菌斜面培养物和肉汤培养基两支试管，右手持接种环，按无菌 操作法取少量细茵，将沾菌的接种环按图20-5在斜倾的接近液面的管壁上轻轻涂抹研匀，试管 直立使沾附在管壁上的细南没入液体中，接种后放37℃恒温箱中培养。 3)结果 ①浑浊生长大肠埃希菌菌液呈均匀混浊，管底有少量沉淀。 ②沉淀生长化脓性链球菌茵液管底有沉淀，菌液无明显浑浊。 ③南膜生长枯草芽胞杆菌菌液表面形成膜状物。 3、半固体培养基移种技术（高层穿刺培养法）用于保存菌种及间接检查细菌有无动力。 (1材料 半固体培养基。 细茵斜面培养物： (2方法 ①将接种针经火焰灭菌冷却后，从斜面培养物表面沾取细菌。 ②用无菌法穿刺接种，将接种针刺入半固体培养基正中央，深度达距管底0,5cm处停止，然 后循原路退出。注意在刺入及拔出时要保持接种针不向穿刺线外摆动。 ③试管口通过火焰灭菌，塞上棉塞。接种针经火焰灭菌。培养物放37℃恒温箱中培养。 (3)结果：有动力的细菌呈扩散生长，无动力的细菌沿穿刺线生长
2、液体培养基移种技术 用于纯种细菌的增菌及观察细菌在液体环境中的生长特征(混浊生长，表面生长或沉淀生长) (1)材料 肉汤培养基 斜面培养物(大肠埃希菌、化脓性链球菌、枯草芽胞杆菌) (2)方法 ①取接种环在火焰上灼烧灭菌、冷却。 ②以“双管移植法”左手持细菌斜面培养物和肉汤培养基两支试管，右手持接种环，按无菌 操作法取少量细菌，将沾菌的接种环按图 20-5 在斜倾的接近液面的管壁上轻轻涂抹研匀，试管 直立使沾附在管壁上的细菌没入液体中，接种后放 37℃恒温箱中培养。 (3)结果 ①浑浊生长大肠埃希菌菌液呈均匀混浊，管底有少量沉淀。 ②沉淀生长化脓性链球菌菌液管底有沉淀，菌液无明显浑浊。 ③菌膜生长枯草芽胞杆菌菌液表面形成膜状物。 3、半固体培养基移种技术(高层穿刺培养法)用于保存菌种及间接检查细菌有无动力。 (1)材料 半固体培养基。 细菌斜面培养物。 (2)方法 ①将接种针经火焰灭菌冷却后，从斜面培养物表面沾取细菌。 ②用无菌法穿刺接种，将接种针刺入半固体培养基正中央，深度达距管底 0.5cm 处停止，然 后循原路退出。注意在刺入及拔出时要保持接种针不向穿刺线外摆动。 ③试管口通过火焰灭菌，塞上棉塞。接种针经火焰灭菌。培养物放 37℃恒温箱中培养。 (3)结果：有动力的细菌呈扩散生长，无动力的细菌沿穿刺线生长