实验指导 目录 实验一硫喷妥钠的兔体药代动力学研究. 实验二罗红霉素犬体药代动力学及相对生物利用度研究 (7) 实验三厄贝沙坦胶囊的人体生物利用度实验设计 ∴(10) 实验四个例药物不良反应的判断 实验五药物临床研究的盲法设计 (28)
实 验 指 导 目 录 实验一 硫喷妥钠的兔体药代动力学研究……………………………………………………（1） 实验二 罗红霉素犬体药代动力学及相对生物利用度研究…………………………………（7） 实验三 厄贝沙坦胶囊的人体生物利用度实验设计…………………………………………（10） 实验四 个例药物不良反应的判断……………………………………………………………（22） 实验五 药物临床研究的盲法设计……………………………………………………………（28）
实验一硫喷妥钠的兔体药代动力学研究 、实验目的 本实验以药代动力学原理为指导,分析测定静脉麻醉时硫喷妥钠在血液中的浓度,研究 体内血药浓度随时间变化的规律,为制定临床用药方案提供依据。 实验材料 1动物 健康家兔12只,♀♂各半,体重(2.5±0.5)kg。安徽医科大学实验动物中心提供 2药物 硫喷妥钠,上海新亚药业有限公司,批号9910501,9902102 3试剂 二氯甲烷,广州新港化工厂产品,批号950503。 045mol·l氢氧化钠溶液,临用前配制 4仪器 S53/54紫外可见分光光度计,上海棱光技术有限公司产品: W-80A旋涡混合器,上海精科实业有限公司产品 TDZ5多管架自动平衡离心机,长沙湘仪离心机有限公司产品: DL-5M低速冷冻离心机 三、实验方法 1动物实验部分 1.12.5%硫喷妥钠溶液的配制 取硫喷妥钠1支(0.5g),用2m生理盐水充分溶解,取lml至另一试管,加入生理盐 水至10ml,混匀 12取家兔,称体重,置于兔架中。平底试管13只编号0-12,加入肝素数滴备用 1.3家兔注射部位去毛、热敷和消毒,待血管扩张后,以左手拇指与食指压住静脉耳根端, 使静脉充盈,给药前用12号针头自耳静脉取血1-1.5ml,置于0管中。 14将5号或7号针头平行刺入静脉,抽动针管,见有回血即可推注。静脉注射25%硫喷 妥钠溶液20mg·kgl。采用小量、缓慢注射法,以每30s注入lml为宜。注射完毕后,拔出 针头,用手或药棉压迫针眼片刻。(一般耳内缘静脉深不易固定,故不用或少用,外缘静脉 浅易固定,常用。)
实验一 硫喷妥钠的兔体药代动力学研究 一、实验目的 本实验以药代动力学原理为指导，分析测定静脉麻醉时硫喷妥钠在血液中的浓度，研究 体内血药浓度随时间变化的规律，为制定临床用药方案提供依据。 二、实验材料 1 动物 健康家兔 12 只，♀♂各半，体重（2.5+0.5）kg。安徽医科大学实验动物中心提供。 2 药物 硫喷妥钠，上海新亚药业有限公司，批号 9910501，9902102。 3 试剂 二氯甲烷，广州新港化工厂产品，批号 950503。 0.45mol•l -1 氢氧化钠溶液，临用前配制。 4 仪器 S53/54 紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司产品； XW-80A 旋涡混合器，上海精科实业有限公司产品； TDZ5 多管架自动平衡离心机，长沙湘仪离心机有限公司产品； DL-5M 低速冷冻离心机。 三、实验方法 1 动物实验部分 1.1 2.5%硫喷妥钠溶液的配制 取硫喷妥钠 1 支（0.5g），用 2ml 生理盐水充分溶解，取 1ml 至另一试管，加入生理盐 水至 10ml，混匀。 1.2 取家兔，称体重，置于兔架中。平底试管 13 只编号 0-12，加入肝素数滴备用。 1.3 家兔注射部位去毛、热敷和消毒，待血管扩张后，以左手拇指与食指压住静脉耳根端， 使静脉充盈，给药前用 12 号针头自耳静脉取血 1-1.5ml，置于 0 管中。 1.4 将 5 号或 7 号针头平行刺入静脉，抽动针管，见有回血即可推注。静脉注射 2.5%硫喷 妥钠溶液 20mg·kg-1。采用小量、缓慢注射法，以每 30s 注入 1ml 为宜。注射完毕后，拔出 针头，用手或药棉压迫针眼片刻。（一般耳内缘静脉深不易固定，故不用或少用，外缘静脉 浅易固定，常用。）
15于给药后5min、15min、25min、35min、45min、1h、2h、3h、4h、5h、6h用12号针 头自另一侧耳缘静脉采血1-1.5m,血标本均用肝素抗凝。 16分离血浆(3000r·minl,l0min)至另一试管,于-20℃保存,直至测定。 2血药浓度测定(紫外分光光度法) 2.1硫喷妥钠标准溶液的配制 精密称取硫喷妥钠对照品100mg,用蒸馏水适量溶解,移入100ml容量瓶中,加水至 刻度,摇匀,得1mg·ml浓度的标准储备液,取储备液配制成3.125、625、12.5、25.0 500、1000、2000μg·mll的硫喷妥钠标准溶液 22标准曲线的制备 精密称取3.125、625、12.5、250、50.0、1000、2000μg·m1的硫喷妥钠标准溶液 0.lml,分置lom具塞试管中,加入0.45 molr-氢氧化钠溶液4ml,混匀。用045moll氢 氧化钠溶液为参比,以lcm吸收池,于大约304nm波长处测定各管的吸光度,以硫喷妥钠 C为横坐标,吸光度A为纵坐标,求得线性回归方程。 23血浆标准曲线的制备 取空白血浆7份分置10ml具塞试管中,分别加入浓度为3.125、6,25、125、250、50.0 1000、2000μg·m的硫喷妥钠标准溶液0.lm,每份用二氯甲烷4m和3ml萃取两次 (旋涡混合提取2min),离心(3000r·minl,10min),合并萃取液6ml。向萃取液中加入 045moll-氢氧化钠溶液4ml,混匀(旋涡混合30s),离心(3000r·min1,10min),抽取 氢氧化钠层供测定。余同标准曲线制备项下。以硫喷妥钠C为横坐标,吸光度A为纵坐标, 求得线性回归方程 24回收率和精密度实验 分别取空白血浆0.5m,精密加入不同浓度的硫喷妥钠标准溶液,使其血浆浓度分别为 625、25.0、1000ug·m1。余同标准曲线制备项下。于1日内5次和连续5日内分别考察 其回收率和日内、日间变异结果。 2.5血浆样品测定 取血浆o.lml,每份用二氯甲烷4ml和3ml萃取两次(旋涡混合提取2min),离心 (3000r·min2, 10min),合并萃取液6ml。向萃取液中加入045mol氢氧化钠溶液4ml, 混匀(旋涡混合30s),离心(3000r·min,l0min),抽取氢氧化钠层供测定。用omin管 为参比,以lcm吸收池,于大约304nm波长处测定各管的吸光度
1.5 于给药后 5min、15 min、25 min、35min、45 min、1h、2h、3h、4h、5h、6h 用 12 号针 头自另一侧耳缘静脉采血 1-1.5ml，血标本均用肝素抗凝。 1.6 分离血浆（3000r·min-1，10min）至另一试管，于-20℃保存，直至测定。 2 血药浓度测定（紫外分光光度法） 2.1 硫喷妥钠标准溶液的配制 精密称取硫喷妥钠对照品 100mg，用蒸馏水适量溶解，移入 100ml 容量瓶中，加水至 刻度，摇匀，得 1 mg·ml-1 浓度的标准储备液，取储备液配制成 3.125、6.25、12.5、25.0、 50.0、100.0、200.0 μg·ml- 1 的硫喷妥钠标准溶液。 2.2 标准曲线的制备 精密称取 3.125、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg·ml- 1 的硫喷妥钠标准溶液 0.1ml，分置 10ml 具塞试管中，加入 0.45mol•l -1 氢氧化钠溶液 4ml，混匀。用 0.45mol•l -1 氢 氧化钠溶液为参比，以 1cm 吸收池，于大约 304nm 波长处测定各管的吸光度，以硫喷妥钠 C 为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，求得线性回归方程。 2.3 血浆标准曲线的制备 取空白血浆 7 份分置 10ml 具塞试管中，分别加入浓度为 3.125、6.25、12.5、25.0、50.0、 100.0、200.0 μg·ml- 1 的硫喷妥钠标准溶液 0.1ml，每份用二氯甲烷 4ml 和 3ml 萃取两次 （旋涡混合提取 2min），离心（3000r·min-1，10min），合并萃取液 6ml。向萃取液中加入 0.45mol•l -1 氢氧化钠溶液 4ml，混匀（旋涡混合 30s），离心（3000r·min-1，10min），抽取 氢氧化钠层供测定。余同标准曲线制备项下。以硫喷妥钠 C 为横坐标，吸光度 A 为纵坐标， 求得线性回归方程。 2.4 回收率和精密度实验 分别取空白血浆 0.5ml，精密加入不同浓度的硫喷妥钠标准溶液，使其血浆浓度分别为 6.25、25.0、100.0μg·ml- 1。余同标准曲线制备项下。于 1 日内 5 次和连续 5 日内分别考察 其回收率和日内、日间变异结果。 2.5 血浆样品测定 取血浆 0.1ml，每份用二氯甲烷 4ml 和 3ml 萃取两次（旋涡混合提取 2min），离心 （3000r·min-1，10min），合并萃取液 6ml。向萃取液中加入 0.45mol•l -1 氢氧化钠溶液 4ml， 混匀（旋涡混合 30s），离心（3000r·min-1，10min），抽取氢氧化钠层供测定。用 0min 管 为参比，以 1cm 吸收池，于大约 304nm 波长处测定各管的吸光度
S53/54紫外可见分光光度计的正常基本操作: 开机自检与自校开机后显示窗两侧8灯全亮,指示进入自检与自校状态,约需十 余分钟。当 TRANS灯亮即说明自校结束进入待机状态,可随时应用 2、重调100%基线(基线校正)在样品室通光位上置入参考样品;在λ START、λEND λINT三标尺下用▲或ⅴ确定起始波长、结束波长、波长间隔参数值(缺省参数为200nm、 1000nm、lnm)后,再按λPara至ANOW灯亮。先后按FUNC2、▲启动基线校正功能。 3、调零按“0%”键,即能自动调整零位。 4、调整100%T将用作背景的空白样品置入样品室光路中,盖下试样盖(同时打开光 门)按一下“100%T”键即能自动调整100%T(一次有误差时可加按)。 5、设定波长按λPara键到λNOW灯亮,按▲或至要求波长,再按λPara键确认 显示窗改变波长至设定值,即完成波长设定步骤 6、改变试样槽位置让不同样品进入光路。 7、改变标尺本仪器设有两类各四种标尺,第一类光度类有: TRANS.透射比、ABS.吸 光度、FACT浓度因子、CONC.浓度直读。各标尺间的转换用Mode键操作,并由“ TRANS.透 射比”,“ABS.吸光度”,“FACT.浓度因子”,“CONC.浓度直读”指示灯分别指示,开 机初始状态为 TRANS,每按一次顺序循环。第二类波长类有:ANOW当前波长、 A START 起始波长、λEND结束波长、λINT波长扫描间隔 测定透明溶液的吸光度的应用操作: 自检校正→设定波长→置入空白→调100%T、0%T→置吸光度标尺→样品置入光路→ 读出数据 3药动学参数的计算 血药浓度一时间数据采用实用药代动力学计算程序3P87( Practical Pharmacokinetic Program- Version87)进行处理。本程序可处理各种给药方法的线性和非线性药代动力学模 型,给出有关药代动力学参数,适用于新药开发研制、药代动力学分析及临床药代动力学计 算。3P87用全屏幕提示方式编辑和修改输入数据,并自动形成输入文件,可供随时调用或 修改。计算结果建立输出文件,随时可以输出各种图表齐备的详细计算结果供用户分析研究, 可对多剂量组数据进行批处理,给出统计结果,并备有简化系统,在输入数据后,即可得出 结果 3.13P87的调用
S53/54 紫外可见分光光度计的正常基本操作： 1、开机自检与自校 开机后显示窗两侧 8 灯全亮，指示进入自检与自校状态，约需十 余分钟。当 TRANS 灯亮即说明自校结束进入待机状态，可随时应用。 2、重调 100%基线（基线校正） 在样品室通光位上置入参考样品；在λSTART、λEND、 λINT 三标尺下用▲或▼确定起始波长、结束波长、波长间隔参数值（缺省参数为 200nm、 1000nm、1nm）后，再按λPara 至λNOW 灯亮。先后按 FUNC2、▲启动基线校正功能。 3、调零 按“0%”键，即能自动调整零位。 4、调整 100%T 将用作背景的空白样品置入样品室光路中，盖下试样盖（同时打开光 门）按一下“100%T”键即能自动调整 100%T（一次有误差时可加按）。 5、设定波长 按λPara 键到λNOW 灯亮，按▲或▼至要求波长，再按λPara 键确认， 显示窗改变波长至设定值，即完成波长设定步骤。 6、改变试样槽位置让不同样品进入光路。 7、改变标尺 本仪器设有两类各四种标尺，第一类光度类有：TRANS．透射比、ABS．吸 光度、FACT．浓度因子、CONC．浓度直读。各标尺间的转换用 Mode 键操作，并由“TRANS．透 射比”，“ABS．吸光度”，“FACT．浓度因子”，“CONC．浓度直读”指示灯分别指示，开 机初始状态为 TRANS，每按一次顺序循环。第二类波长类有：λNOW 当前波长、λSTART 起始波长、λEND 结束波长、λINT 波长扫描间隔。 测定透明溶液的吸光度的应用操作： 自检校正→设定波长→置入空白→调 100%T、0% T→置吸光度标尺→样品置入光路→ 读出数据 3 药动学参数的计算 血药浓度-时间数据采用实用药代动力学计算程序 3P87（Practical Pharmacokinetic Program-Version 87）进行处理。本程序可处理各种给药方法的线性和非线性药代动力学模 型，给出有关药代动力学参数，适用于新药开发研制、药代动力学分析及临床药代动力学计 算。3P87 用全屏幕提示方式编辑和修改输入数据，并自动形成输入文件，可供随时调用或 修改。计算结果建立输出文件，随时可以输出各种图表齐备的详细计算结果供用户分析研究， 可对多剂量组数据进行批处理，给出统计结果，并备有简化系统，在输入数据后，即可得出 结果。 3.1 3P87 的调用
使用硬盘及一个软盘驱动器时,将3P87程序盘放入A驱动器,键入[A3P87并按 ENTER]键,即可显示3P87程序的首页,再任意按一键即显示主菜单( MAIN MENU):1 输入或修改数据:2、用主数据计算药代动力学参数,选择模型;3、对多组数据的批处理 4、用户指定算法和条件计算药代动力学参数;5、计算结果输出:6、药代动力学参数计算 的简化系统;7、药代动力学模型的说明;8、退出3P87程序。 32在屏幕出现程序主菜单后,由键盘键功能数码[]时,屏幕左上角显示 Please Execute a: inpl,键入ainp并回车后,屏幕显示输入菜单( INPUT MENU),供输入功能的选择。其 内容为:1、输入数据:2、修改标题文件:;3、修改浓度-时间数据:4、增添浓度-时间数据 5、删除浓度时间数据:6、显示输入数据;7、打印输入数据;8、返回主菜单。 在屏幕显示输入菜单后,由键盘键功能数码[时,即显示标题文件内容,用户按光标 提示项目逐项输入标题文件内容,包括有:1、药名或文件名:2、实验对象:3、研制单位 4、日期:5、实验者;6、计算者:7、测定灵敏度;8、浓度单位:9、测定精密度(CV%) 10、时间单位:11、给药剂量单位。其中1、8、10和11项与实验记录及计算有密切关系 必须输入。 3.3输入给药途径 屏幕显示三种给药途径:1、静脉推注:2、静脉滴注:3、非静脉给药。 34输入剂量组数 3.5输入各剂量组的个体数目、剂量和静脉滴注时的滴注时间 3.6输入浓度-时间数据:1、输入主数据;2、数据记录序号:3、输入浓度-时间数据:4、 建立输入文件:5、显示或打印输入文件。 3.7药代动力学计算:1、用主数据进行计算:2、批处理的计算:3、指定算法和条件的计 算 3.8计算结果的输出 屏幕显示主菜单后,由键盘键功能数码[5]时,即进入输出程序,屏幕显示[ File name, 要求键入文件名,并予确认,然后显示输出菜单( OUTPUT MENU),输出菜单包括5项: 1、常规打印输出:2、个别计算结果显示;3、相关图及散点图:4、输出文件的清单打印 5、返回主菜单。在屏幕显示输出菜单时,键[则显示常规打印输出菜单( ROUTINE PRINT oUT),其内容有7项:1、标题文件:2、供选择模型用的计算结果:3、批处理的结果;4、 用户指定计算的结果:5、个别数据的计算结果:6、统计矩结果:7、返回输出菜单
使用硬盘及一个软盘驱动器时，将 3P87 程序盘放入 A 驱动器，键入[A:3P87]并按 [ENTER]键，即可显示 3P87 程序的首页，再任意按一键即显示主菜单（MAIN MENU）：1、 输入或修改数据；2、用主数据计算药代动力学参数，选择模型；3、对多组数据的批处理； 4、用户指定算法和条件计算药代动力学参数；5、计算结果输出；6、药代动力学参数计算 的简化系统；7、药代动力学模型的说明；8、退出 3P87 程序。 3.2 在屏幕出现程序主菜单后，由键盘键功能数码[1]时，屏幕左上角显示 Please Execute [a:inp]，键入 a:inp 并回车后，屏幕显示输入菜单（INPUT MENU），供输入功能的选择。其 内容为：1、输入数据；2、修改标题文件；3、修改浓度-时间数据；4、增添浓度-时间数据； 5、删除浓度-时间数据；6、显示输入数据；7、打印输入数据；8、返回主菜单。 在屏幕显示输入菜单后，由键盘键功能数码[1]时，即显示标题文件内容，用户按光标 提示项目逐项输入标题文件内容，包括有：1、药名或文件名；2、实验对象；3、研制单位； 4、日期；5、实验者；6、计算者；7、测定灵敏度；8、浓度单位；9、测定精密度（CV%）； 10、时间单位；11、给药剂量单位。其中 1、8、10 和 11 项与实验记录及计算有密切关系， 必须输入。 3.3 输入给药途径 屏幕显示三种给药途径：1、静脉推注；2、静脉滴注；3、非静脉给药。 3.4 输入剂量组数 3.5 输入各剂量组的个体数目、剂量和静脉滴注时的滴注时间 3.6 输入浓度-时间数据：1、输入主数据；2、数据记录序号；3、输入浓度-时间数据；4、 建立输入文件；5、显示或打印输入文件。 3.7 药代动力学计算：1、用主数据进行计算；2、批处理的计算；3、指定算法和条件的计 算 3.8 计算结果的输出 屏幕显示主菜单后，由键盘键功能数码[5]时，即进入输出程序，屏幕显示[File name]， 要求键入文件名，并予确认，然后显示输出菜单（OUTPUT MENU），输出菜单包括 5 项： 1、常规打印输出；2、个别计算结果显示；3、相关图及散点图；4、输出文件的清单打印； 5、返回主菜单。在屏幕显示输出菜单时，键[1]则显示常规打印输出菜单（ROUTINE PRINT OUT），其内容有 7 项：1、标题文件；2、供选择模型用的计算结果；3、批处理的结果；4、 用户指定计算的结果；5、个别数据的计算结果；6、统计矩结果；7、返回输出菜单
供选择模型用的计算结果包括:1、拟合优度比较表;2、主数据拟合曲线;3、主数据的F 检验;4、主数据的统计矩计算结果。 3.9房室数的选择 可根据F检验和AIC值选择房室数,当F检验有显著意义(P0.05)时,则取房室数少者为宜。 3.10权重选择 在估算药代动力学参数时,如何选择权重在实践和理论上都是一个重要的问题,为许多 学者所关注。本程序中给出三种最常用的权重:1、1/C及1/C2,供用户选择。如何选择权 重,至今意见不一,但有以下意见可供参考:首先比较拟合优度值( Goodness of fit),数值 越小,表示拟合越好,如数值相等或相近时,再同时结合最低检测浓度,参考最大绝对误差 及相对误差。一般来说,权重为1时,最大绝对误差较小,对高浓度数据拟合较好,有利于 计算表观分布容积及生物利用度。权重为1/C2时,最大相对误差较小,对低浓度数据拟合 较好,有利于计算消除相半衰期。权重为1C时,通常能兼顾高低浓度的数据,但最大绝对 误差及最大相对误差,往往并非最小。 四、实验结果 1硫喷妥钠标准曲线的绘制 试管号 4 6 硫喷妥钠浓度 吸光度 (A) 标准曲线回归方程及相关系数: 2硫喷妥钠的血药浓度 试管号 10 吸光度 (A) 血药浓度
供选择模型用的计算结果包括：1、拟合优度比较表；2、主数据拟合曲线；3、主数据的 F 检验；4、主数据的统计矩计算结果。 3.9 房室数的选择 可根据 F 检验和 AIC 值选择房室数，当 F 检验有显著意义（P0.05）时，则取房室数少者为宜。 3.10 权重选择 在估算药代动力学参数时，如何选择权重在实践和理论上都是一个重要的问题，为许多 学者所关注。本程序中给出三种最常用的权重：1、1/C 及 1/C 2，供用户选择。如何选择权 重，至今意见不一，但有以下意见可供参考：首先比较拟合优度值（Goodness of fit），数值 越小，表示拟合越好，如数值相等或相近时，再同时结合最低检测浓度，参考最大绝对误差 及相对误差。一般来说，权重为 1 时，最大绝对误差较小，对高浓度数据拟合较好，有利于 计算表观分布容积及生物利用度。权重为 1/C 2 时，最大相对误差较小，对低浓度数据拟合 较好，有利于计算消除相半衰期。权重为 1/C 时，通常能兼顾高低浓度的数据，但最大绝对 误差及最大相对误差，往往并非最小。 四、实验结果 1 硫喷妥钠标准曲线的绘制 试管号 1 2 3 4 5 6 硫喷妥钠浓度 （ug·ml-1） 吸光度 （A） 标准曲线回归方程及相关系数： 2 硫喷妥钠的血药浓度 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 吸光度 （A） 血药浓度 (ug•ml-1 )
3硫喷妥钠的药代动力学参数 试验组ke(h)tn(ka)(h)tn(ke(h)C(max)(ugm)AUC(ugml)hCL( mg/kg/h/(ug/m) 五、讨论 1为什么要做药动学实验? 2标准曲线的制备应注意哪些问题? 3从你做的结果讨论药代动力学参数的生理意义及如何制定临床用药方案
3 硫喷妥钠的药代动力学参数 试验组 ke（h -1） t1/2（ka）（h） t1/2（ke）（h） C（max）（ug/ml） AUC（ug/ml）·h CL（mg/kg/h/(ug/ml)） 1 2 3 4 5 6 χ s 五、讨论 1 为什么要做药动学实验？ 2 标准曲线的制备应注意哪些问题？ 3 从你做的结果讨论药代动力学参数的生理意义及如何制定临床用药方案
实验二罗红霉素的犬体药代动力学及相对生物利用度研究 、实验目的 1.掌握微生物法测定罗红霉素血药浓度的基本原理与操作 2.熟悉相对生物利用度的测定。 3.了解罗红霉素的动物药代动力学研究过程 实验材料 1动物 健康犬12只,♂,体重12kg左右,由安徽医科大学实验动物中心提供(皖医实动准 第01号)。 2药品 罗红霉素片,商品名罗迈新,丽珠集团丽珠制药厂,规格150mg/片,批号020602。 罗红霉素片,商品名浦虹,上海医药工业研究院亚东药业公司浦东药厂,规格150mg/ 片,批号020601 罗红霉素标准品,含量949.5(u/mg),批号020205M 3检定菌 藤黄微球菌标准菌株CMC℃(B)28001,卫生部药品生物制品检验所提供 4试剂 磷酸盐缓冲液(pH60),安徽医科大学第一附属医院检验科临床微生物室配制,过滤, 115℃高压30分钟。 培养基Ⅱ,安徽医科大学第一附属医院检验科临床微生物室配制,过滤,5℃高压30 分钟。 营养琼脂干粉,杭州天和微生物试剂厂,按其说明书配制,用于转种藤黄微球菌标准 菌株和细菌菌落计数 实验方法 1标准曲线制备 将已高压灭菌的培养基Ⅱ加热溶解后倾入无菌培养皿,藤黄微球菌标准菌株菌液 (10-10 5CFU/ml)均匀涂抹无菌培养皿,置35℃温箱10-20分钟。用直径为3.5mm打孔器 在培养皿打2孔,用于加入标准品及血浆样品。精密称取罗红霉素标准品50mg,用lm无 水乙醇溶解后,加入4mPH60磷酸盐缓冲液,制成储备液(1000mng·P)。取0.lm储备
实验二 罗红霉素的犬体药代动力学及相对生物利用度研究 一、实验目的 1．掌握微生物法测定罗红霉素血药浓度的基本原理与操作。 2．熟悉相对生物利用度的测定。 3．了解罗红霉素的动物药代动力学研究过程。 二、实验材料 1 动物 健康犬 12 只，♂，体重 12kg 左右，由安徽医科大学实验动物中心提供（皖医实动准 第 01 号）。 2 药品 罗红霉素片，商品名罗迈新，丽珠集团丽珠制药厂，规格 150mg/片，批号 020602。 罗红霉素片，商品名浦虹，上海医药工业研究院亚东药业公司浦东药厂，规格 150mg/ 片，批号 020601。 罗红霉素标准品，含量 949.5（u/mg），批号 020205M。 3 检定菌 藤黄微球菌标准菌株 CMCC（B）28001，卫生部药品生物制品检验所提供。 4 试剂 磷酸盐缓冲液（pH6.0），安徽医科大学第一附属医院检验科临床微生物室配制，过滤， 115℃高压 30 分钟。 培养基Ⅱ，安徽医科大学第一附属医院检验科临床微生物室配制，过滤，115℃高压 30 分钟。 营养琼脂干粉，杭州天和微生物试剂厂，按其说明书配制，用于转种藤黄微球菌标准 菌株和细菌菌落计数。 三、实验方法 1 标准曲线制备 将已高压灭菌的培养基Ⅱ加热溶解后倾入无菌培养皿，藤黄微球菌标准菌株菌液 （104 -105CFU/ml）均匀涂抹无菌培养皿，置 35℃温箱 10-20 分钟。用直径为 3.5mm 打孔器 在培养皿打 2 孔，用于加入标准品及血浆样品。精密称取罗红霉素标准品 50mg，用 1ml 无 水乙醇溶解后，加入 4mlPH6.0 磷酸盐缓冲液，制成储备液（1000 mg·l -1）。取 0.1ml 储备
液加入99mlPH60磷酸盐缓冲液,制成中间液体(100mg·),用犬血浆稀释成10、5、 25、1.25、0.625、0.3125、0.15625mg·2,取20u加入上述孔中,置35℃温箱16小时, 用游标卡尺测量抑菌环直径(mm)。以抑菌环直径D为横坐标,浓度C(mg·上)的对数 为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为:1gC=1.219+0083D,r=0.9958 2回收率试验 分别制备高、中、低3种浓度的罗红霉素血浆样品,按标准曲线制备项下方法操作, 将抑菌环直径代入标准曲线计算罗红霉素浓度,以测得值与加入值之比计算回收率。 3精密度试验 分别制备高、中、低3种浓度的罗红霉素血浆样品,按标准曲线制备项下方法操作,1 日内连续测定5次,计算日内相对标准差;将制备的高、中、低3种浓度的罗红霉素血浆样 品连续测定5日,计算日间相对标准差 4药动学试验方案 12只犬随机分为2组,每组6只,用药前禁食12小时,用药后禁食4小时,禁水2小 时。供试药物组与对照药物组分别灌胃浦虹、罗迈新2片(150mg×2),分别于Oh(给药前) 及给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、25、3、4、6、8、12、18、24、36、48、60、72h。 采血3m,血标本收集于一次性肝素抗凝的负压真空采血管(成都瑞琪 C DRICH产品,批 号020313)内,离心(3000r·minl,l0min)分离出血浆,血浆样品保存于-20℃待测。血 药浓度测定方法同标准曲线 5数据处理 血药浓度时间数据采用3p87药代动力学软件计算。峰浓度(Cm)和达峰时间(Tmx) 为实测值,对浦虹和罗迈新的主要药代动力学参数采用配对t检验进行统计分析,以罗迈新 药时曲线下面积为标准,计算浦虹的相对生物利用度。 四、实验结果 1罗红霉素标准曲线的绘制 皿编号 罗红霉素浓度C(mg·)10 52.51.250.6250.31250.15625 抑菌环直径D(mm)25/2623/23202018/1713/13994/4 26/2622/2320/2015/1513/139/844 平均抑菌环直径D(mm)25.75
液加入 9.9mlPH6.0 磷酸盐缓冲液，制成中间液体（100 mg·l -1），用犬血浆稀释成 10、5、 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625mg·l -1，取 20ul 加入上述孔中，置 35℃温箱 16 小时， 用游标卡尺测量抑菌环直径（mm）。以抑菌环直径 D 为横坐标，浓度 C（mg·l -1）的对数 为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：lgC=-1.219+0.083D，r =0.9958。 2 回收率试验 分别制备高、中、低 3 种浓度的罗红霉素血浆样品，按标准曲线制备项下方法操作， 将抑菌环直径代入标准曲线计算罗红霉素浓度，以测得值与加入值之比计算回收率。 3 精密度试验 分别制备高、中、低 3 种浓度的罗红霉素血浆样品，按标准曲线制备项下方法操作，1 日内连续测定 5 次，计算日内相对标准差；将制备的高、中、低 3 种浓度的罗红霉素血浆样 品连续测定 5 日，计算日间相对标准差。 4 药动学试验方案 12 只犬随机分为 2 组，每组 6 只，用药前禁食 12 小时，用药后禁食 4 小时，禁水 2 小 时。供试药物组与对照药物组分别灌胃浦虹、罗迈新 2 片（150mg×2），分别于 0h（给药前） 及给药后 0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、18、24、36、48、60、72h。 采血 3ml，血标本收集于一次性肝素抗凝的负压真空采血管（成都瑞琪 C.D.RICH 产品，批 号 020313）内，离心（3000r•min-1，10min）分离出血浆，血浆样品保存于-20℃待测。血 药浓度测定方法同标准曲线。 5 数据处理 血药浓度-时间数据采用 3p87 药代动力学软件计算。峰浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax） 为实测值，对浦虹和罗迈新的主要药代动力学参数采用配对 t 检验进行统计分析，以罗迈新 药时曲线下面积为标准，计算浦虹的相对生物利用度。 四、实验结果 1 罗红霉素标准曲线的绘制 平皿编号 1 2 3 4 5 6 7 罗红霉素浓度 C（mg·l -1） 10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125 0.15625 抑菌环直径 D（mm） 25/26 23/23 20/20 18/17 13/13 9/9 4/4 26/26 22/23 20/20 15/15 13/13 9/8 4/4 平均抑菌环直径 D（mm） 25.75 22.75 20 16.25 13 8.75 4
标准曲线回归方程及相关系数:lgC=1.219+0.083D,r=09958 2罗红霉素的血药浓度 平皿号 12345678910111213141516171819 平均抑菌环直径 mm 血药浓度 (mg·) 3浦虹和罗迈新的药代动力学参数(x+s,m=6) 药代动力学参数 罗迈新 Ta (h) tie(ka)(h) tie(ke)(h) AUC(mg·h·L) V/F (L) Mrt (h) 4浦虹相对生物利用度 五、讨论 1、从罗红霉素的药动学过程看,其主要优点是什么? 2、如何进行浦虹和罗迈新的生物等效性评价?
标准曲线回归方程及相关系数：lgC=-1.219+0.083D，r =0.9958 2 罗红霉素的血药浓度 平皿号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 平均抑菌环直径 （mm） 血药浓度 （mg·l -1） 3 浦虹和罗迈新的药代动力学参数（χ+ s，n=6） 药代动力学参数 浦 虹 罗迈新 Cmax（mg·L -1） Tmax（h） ke（h -1） t1/2（ka）（h） t1/2（ke）（h） AUC（mg·h·L -1 ） V/F（L） MRT（h） 4 浦虹相对生物利用度 五、讨论 1、 从罗红霉素的药动学过程看，其主要优点是什么？ 2、 如何进行浦虹和罗迈新的生物等效性评价？