第十六章基因工程和蛋白质工程简介 第一节DNA重组与基因工程 第二节蛋白质工程简介 第三节核酸研究技术简介 返回
第十六章 基因工程和蛋白质工程简介 第一节 DNA重组与基因工程 第二节 蛋白质工程简介 第三节 核酸研究技术简介 返回
第一节DNA重组和基因工程 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA(目的基因)和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使 外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖(cloning, 克隆)，或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物 原有的遗传性状。 DNA重组的技术路线 二、基因工程的应用与前景 三、DNA体外重组常用的酶 巡回日
第一节 DNA重组和基因工程 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使 外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning， 克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物 原有的遗传性状。 一、DNA重组的技术路线 二、基因工程的应用与前景 三、DNA体外重组常用的酶
DNA重组的 Plansmid 十 vector 技术路线 Foreign DNA to be inserted Joining 1、目的基因的制备 Recombinant 2、载体的构建 DNA molecule Introduction into host 3、目的基因与载体 cells by transformation of viral infection 的重组 4、重组体导入宿主 Host chromateme 细胞进行扩增 Cloning Slection for cells coteining a recombinant 5、克隆基因的鉴定 DNA molecule
DNA重组的 技术路线 Foreign DNA to be inserted Plansmid vector Joining Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromateme Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule Cloning + 1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定
植物冠瘿瘤 肿瘤的形态学和 EcoRI 蟑鱼碱合成 BamHI T-DNA Pstl Sall 氨苄青霉素 四环素 抗性基因 抗性基因 (ampR) (tetR) 毒性基因 蟑鱼碱 分解基因 农杆碱 复制起点 分解基因 (ori) Poull 蟑鱼碱Ti质粒 pBR322质粒的结构 Ti质粒结构 可
Ti质粒结构 植物冠瘿瘤 pBR322质粒的结构
头部前体 ADNA 用限制性内切酶 除去中间一段 与外源DNA连接 A蛋白 多联体 COS% DNA 太小不能被包装 重组载体的体外包装 cos 带有外源DNA的 λ噬菌体 成熟的颗粒 以入噬菌体为载体进 在宿主细胞内进行 行DNA克隆 DNA的装配过程
以噬菌体为载体进 行DNA克隆 DNA 用限制性内切酶 除去中间一段 与外源DNA连接 重组载体的体外包装 带有外源DNA的 噬菌体 太小不能被包装 头部前体 多联体 DNA A蛋白 COS COS COS 成熟的颗粒 在宿主细胞内进行 DNA的装配过程
入噬菌体感染大肠杆菌的途径 λ噬菌体 A DNA ADNA 溶解途径 进入细胞 入噬菌体 活性 E.coli 容源途径 DNA 细菌细胞 DNA整合到E.coli基因组 勾
噬菌体感染大肠杆菌的途径
DNA重组体的筛选 ·载体特征的直接筛选 。菌落的原位杂交 。免疫学方法 ☒
DNA重组体的筛选 • 载体特征的直接筛选 • 菌落的原位杂交 • 免疫学方法
如果外源DNA 如果外源DNA 插入，氨卞青霉 EcoRI 素扰性基因失活 BamHI 插入，四环素扰性 基因失活 PstI Sall 氨苄青霉素 四环素 抗性基因 抗性基因 (ampR) (tetR) 复制起点 (ori) PvulI pBR322质粒结构 可
pBR322质粒结构 如果外源DNA 插入，氨卞青霉 素抗性基因失活 如果外源DNA 插入，四环素抗性 基因失活
复印至硝酸 纤维素膜上 用NaOH菌体裂 细菌菌落 解DNA变性 0 单链DNA结 合到膜上 32P-cDNA 杂交 放射自显影 原位杂交法筛选 DNA重组体图解 与放射性cDNA杂 交的菌落的斑点
原位杂交法筛选 DNA重组体图解 复印至硝酸 纤维素膜上 用NaOH菌体裂 解DNA变性 杂交 放射自显影 32P-cDNA 与放射性cDNA杂 交的菌落的斑点 细菌菌落 单链DNA结 合到膜上
限制性酶切割 限制片段 Southern 印迹法 DNA分子 琼脂糖电泳 1111/11/ 11∥1// 带有DNA片 1111111/ 段的凝胶 /1/m111 用缓冲液 转移至硝酸纤维素膜上 转移 DNA 凝胶 滤膜 与放射性标记 DNA探针杂交 U1I1111 吸附有DNA 片段的膜 放射自显影 //l∥/I/
Southern 印迹法 DNA分子 限制性酶切割 限制片段 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记 DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片 段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液 转移 DNA 吸附有DNA 片段的膜