生化实验技术专题 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例 介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事 项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原 理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸 测定的主要方法
生化实验技术专题 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例 介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事 项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原 理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸 测定的主要方法
目录 东 第一节生物大分子物质的制备 第二节几种主要的生物化学实验技术 第三节生物分子的检测
目录 第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几种主要的生物化学实验技术 第三节 生物分子的检测
第一节生物大分子物质的制备 般过程 •材料的选择和处理 •确立测定方法 •细胞的破碎 有效成分的抽提 二. 注意事项 有效成分的浓缩 三.纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化
第一节 生物大分子物质的制备 一．一般过程 二．注意事项 三．纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 •材料的选择和处理 •确立测定方法 •细胞的破碎 •有效成分的抽提 •有效成分的浓缩
生物大分子分离纯化的一般步骤 层析法 电泳法 生物组织→无细胞提取液→粗产品→ →结晶 超离心法 超滤 前处理→|一粗分级一→丨←一细分级 → 材料选择与处理 ·盐析（硫酸铵盐析） 细胞破碎（机械破 ·等点电沉淀 碎、溶账和自溶、 ·有机溶剂沉淀 酶解、化学处理) 透析
生物大分子分离纯化的一般步骤 层析法 电泳法 超离心法 超滤 •盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ •材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理） 生物组织→无细胞提取液→粗产品→ →结晶
几种主要沉淀方法比较 方法 原理 优点 缺点 应用范围 謙集牌餐 盆 辨力差， 化倍数 1.沉淀法 蛋白质的 盐析作用 家注 作用，重 冒0 笑盥 程 或级结 蛋白质、 多 2. 有机溶 脱水作用 操分强 作简便， 肽、核酸 剂沉淀 和降低分 辨力较 甕 于落配 质变成 电常数 复 本较高 药芬 沉淀 等电点、热 变性、酸 选 3. 选择性 整 方法 应用范围 沉淀法 性 可逆 种类较 较窄 棼生酱 质的沉淀 沉淀作 多
几种主要沉淀方法比较
调整硫酸铵溶液饱和度计算表 (硫酸铵最终浓度%饱和度) 10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 每升溶液需加入固体硫疏酸铵的克数 0 56114144176196209243277313351390430472 561 662767 10 57 86118137150183216251288326365406 592694 20 29 59 78911231551892252623003 382 520 619 25 30 49 61 93125158193230261 583 19 162 6 酸铵起始 30 30 62 94127 33 12 43 74 107 35 31 63 94 129 40 31 63 97 132 45 32 65 99134 度% 50 33 66 101 55 33 67103 60 34 69 105 和 65 34 70 07 70 35 72 53 75 36 115 198 80 77 157 90 79
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
注意事项 1.控制适当的pH 2.控制低温 3.注意提取过程中的溶液环境 4.防止提纯过程中丢失一些辅助因子或亚基
注意事项 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 (mg） (U) (U/mg蛋白) (%) 1、 粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3
宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3
第二节几种重要的生物化学实验技术 层析技术 二、电泳技术 三、离心技术
第二节 几种重要的生物化学实验技术 一、层析技术 二 、电泳技术 三 、离心技术
层析技术(chromatography) 1.层析技术一般原理 2.层析技术分类及应用 不不
一．层析技术（chromatography） 1．层析技术一般原理 2．层析技术分类及应用