基因直接进化研完进展 DNA Shuffling技木 吴琦 四川农业大学 二OO三年九月
基因直接进化研究进展 ——DNA Shuffling技术 四川农业大学 二○○三年九月 吴琦
生物的自然进化 >进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 产进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因（同源性） 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物
生物的自然进化 ➢进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 ➢进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物
人工获取新基因的方法 常规的基因工程方法 生物功能—蛋白质·基因 >新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计 基因的直接进化(directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题
人工获取新基因的方法 ➢常规的基因工程方法 生物功能 蛋白质 基因 ➢新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计 ➢基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题
基因直接进化的用途 +提高酶活性一 天门冬氨酸氨基转移酶活性 提高30倍 +改变底物特异性和对映异构体选择性一 酯酶可水解非天然酯类 +改善酶的工艺性一冷适应和热适应酶 +改变酶的拓扑结构一二体酶变为单体酶 +获取许多新的理论知识
基因直接进化的用途 提高酶活性——天门冬氨酸氨基转移酶活性 提高30倍 改变底物特异性和对映异构体选择性— — 酯酶可水解非天然酯类 改善酶的工艺性——冷适应和热适应酶 改变酶的拓扑结构——二体酶变为单体酶 获取许多新的理论知识
TLPs的失活曲线 100 10 20 40 60 80100 120140 160 180 Time (minutes)
TLPs 的失活曲线
TLP-ste突变蛋白的三维结构
TLP-ste突变蛋白的三维结构
酶拓扑结构的变化 H Glu 20a
酶拓扑结构的变化
基因直接进化的步骤 >突变 基因突变库的建立 产筛选 基因突变库的活体或离体 >基因复制与遗传
基因直接进化的步骤 ➢突变 基因突变库的建立 ➢筛选 基因突变库的活体或离体筛选 ➢基因复制与遗传
建立基因突变库的方法 >定向诱变： 点突变—碱基删除、增补和替换 随机诱变： 易错PCR法(Error-prone PCR) 降低一种dNTP的量（降至5%-10%） 加入dTP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/LMn+
建立基因突变库的方法 ➢定向诱变： 点突变——碱基删除、增补和替换 ➢随机诱变： 易错PCR法(Error-prone PCR)—— ❖ 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） ❖ 加入dITP来代替被减少的dNTP ❖ 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
(a)Oligonucleotide-directed mutagenesis ()Base-pair substitution Oligo binds to ssDNA Polymerization Replication in cell Oligo- SSDNA A (间Insertion (iii)Deletion (b)Cassette replacement (c)Deletion (d)Sets of deletions (e)PCR mutagenesis ·1 st PCR to obtain long primer Product■T ·2 nd PCR using long primer Product ■