第二章蛋白质研究技术 第一节蛋白质的分离纯化 第二节蛋白质的鉴定 第三节蛋白质的检测 第四节蛋白质的结构分析 华中农业大学生物化学精品课程组 yangzq@mail.hzau.edu.cn
第二章 蛋白质研究技术 第一节 蛋白质的分离纯化 第二节 蛋白质的鉴定 第三节 蛋白质的检测 第四节 蛋白质的结构分析
第一节蛋白质的分离与纯化 一、蛋白质分离纯化的基本原则 二、蛋白质分离纯化的方法
第一节 蛋白质的分离与纯化 一、蛋白质分离纯化的基本原则 二、蛋白质分离纯化的方法
一、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择丰度高、便于提前的材料 2、了解目的蛋白质的稳定性 3、探索有效的抽提法和浓缩法 4、建立一套层析的组合 5、以较好的方法贮存
一、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择丰度高、便于提前的材料 2、了解目的蛋白质的稳定性 3、探索有效的抽提法和浓缩法 4、建立一套层析的组合 5、以较好的方法贮存
蛋白质分离纯化的方法 粗提： ①盐析 ③有机溶剂沉淀 ②结晶 ④等电点沉淀 精提： ①离心(centrifugation) ②电泳(electrophoresis) ③层析(chromatography)
一、蛋白质分离纯化的方法 粗提： ① 盐 析 ③ 有机溶剂沉淀 ② 结 晶 ④ 等电点沉淀 精提 ： ① 离心（centrifugation ） ② 电泳（electrophoresis ） ③ 层析（chromatography ）
离心(centrifugation) 原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子） 有不同的质量(mass)或密度(density),因此在离 场中有不同沉降速率。 ·不同的蛋白质分子量差别很大，但密度差别很小。 蛋白质的平均密度是1.37gcm3。除非蛋白质结合 了脂或碳水化合物，蛋白质之间密度的差异不会超 过15%。 ·离心力由转子中心到蛋白质界面的距离来决定
① 离心（centrifugation） 原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子） 有不同的质量（mass）或密度（density），因此在离 场中有不同沉降速率。 不同的蛋白质分子量差别很大，但密度差别很小。 蛋白质的平均密度是 1.37 g/cm3。 除非蛋白质结合 了脂或碳水化合物，蛋白质之间密度的差异不会超 过 15%。 离心力由转子中心到蛋白质界面的距离来决定
离心(centrifugation) 回沉降系数(sedimentation constant):每单位离 心场的速度(S)。与蛋白质的密度和形状有关， 也与介质的密度和粘度有关。 回离心可用于两个方面： ◆作为分离技术：从混合物中分离一种成分； ◆作为分析技术：测定物质的物理性质，如分子 量，密度，形状及平衡结合常数(equilibrium binding constants)
离心（centrifugation） 沉降系数（sedimentation constant）：每单位离 心场的速度（S）。与蛋白质的密度和形状有关， 也与介质的密度和粘度有关。 离心可用于两个方面： (作为分离技术：从混合物中分离一种成分； (作为分析技术：测定物质的物理性质，如分子 量，密度，形状及平衡结合常数（equilibrium binding constants）
离心(centrifugation) I.差速离心(differential centrifugation) IⅡ.速率区带离心(rate-zonal centrifugation)
离心（centrifugation） Ⅰ. 差速离心（differential centrifugation） Ⅱ. 速率区带离心（rate-zonal centrifugation）
I,差速离心(differential centrifugation) Dlfforontlal contrifugation mpla 回从组织匀浆中把可溶性 More dense particle 的蛋白质与细胞的不溶 性成分分开。 Centrifugal force 回离心后，蛋白质留在上清 液(supernatant)中， 其他成分形成沉淀 (pellet)
Ⅰ. 差速离心（differential centrifugation） 从组织匀浆中把可溶性 的 蛋白质与细胞的不溶 性成分分开。 离心后，蛋白质留在上清 液（supernatant）中， 其他成分形成沉淀 （pellet）
差速离心(differential centrifugation) Filter homogenate to remove clumps of 采用不同的 unbroken cells, connective 速度和时间 tissue,etc. Centrifuge 可以分离不 同的细胞结 构 600g× Flltered -Mltochondria, Plasma -Ribosomal Soluble nomogenate chloroplasts, membrane, subunits, portlon lysosomes, microsoma small of and fraction polyrlba- cytoplasm peroxlsomes (fragments of somes (cytosol) endoplasmic retlculum) and large polyrlbosames 速度个时间
差速离心（differential centrifugation） 速度 时间 采用不同的 速度和时间 可以分离不 同的细胞结 构
Ⅱ.速率区带离心(rate-zonal Rate-zonal centrifugatlon centrifugation Larger particle Smaller particle- ©用蔗糖、甘油或氯化铯形成密度 度； Contrifuge g高速离心机（~40,000r/min); Centrifugal force Partices suttle according to ©离心后，被分离的物质分布在相 的密度区带内； 旷注意：控制时间。太短，达不到 Collect Hole nd d 充分分离；太长，分离物沉淀到 心管底部
Ⅱ. 速率区带离心（rate-zonal centrifugation） )用蔗糖、甘油或氯化铯形成密度 度； )高速离心机（~ 40,000 r/min）； )离心后，被分离的物质分布在相 的密度区带内； )注意：控制时间。 太短，达不到 充分分离；太长，分离物沉淀到 心管底部