第十章核酸的生物合成 在生物界，物种通过遗传使其生物学特性、形状能世代相传。现代科学已经证明遗 传的物质基础是核酸。核酸是贮存和传递遗传信息的生物大分子。生物体的传信息是 以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中通 过DNA的复制把遗传信息由亲代传递给子代，在子代的个体发有过程中遗传信息由DNA 传递到RNA,最后翻译成特异的蛋白质，表现出与亲代相似的遗传性状。 1958年，Crik提出了概括遗传信息从一种分子传向另一种分子的理论中心法则 (Central dogma) DA、RNA、蛋白质 这个由DNA决定RNA分子的碱基顺序又由RNA决定蛋白质分子的氨基酸顺序的 理论称为中心法则。 在某些情况下RNA也是重要的遗传物质，如在RNA病毒中，RNA是遗传信息的 带者，具有自我复制的能力，并同时作为mRNA,指导病毒蛋白质的生物合成。在致癌 RNA病毒中，RNA在逆转录酶的作用下，以逆转录(reverse transcription)的方式将遗 传信息RNA传递给DNA分子。 因此，1971年，Cick对中心法则作了进一步补正与完善。修改的中心法则如图10-1 所表示。 复制 毯轻录 DNAY 翻译 蛋白质 图10-1中心法则 图中实线表示遗传信息的一般流向， 虚线表示特殊的流向情况。这个中心法则揭 了核酸与蛋白质合成之间的密切联系和共同规律。 遗传信总的传递和表达主要通过复制、转录和翻译进行。复制(replication)是指以 原来DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程：转录(transcription)是以DNA 分子为模板合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程：翻译(translation)是在由rRNA 和蛋白质组成的核糖核蛋白体（简称核糖体）上 mRNA为 莫板，根据每3个相邻核 苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由RNA运送活化的氨基酸，GTP提供所需能 293
293 第十章 核酸的生物合成 在生物界，物种通过遗传使其生物学特性、形状能世代相传。现代科学已经证明遗 传的物质基础是核酸。核酸是贮存和传递遗传信息的生物大分子。生物体的遗传信息是 以密码的形式编码在 DNA 分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中通 过DNA的复制把遗传信息由亲代传递给子代，在子代的个体发育过程中遗传信息由DNA 传递到 RNA，最后翻译成特异的蛋白质，表现出与亲代相似的遗传性状。 1958 年，Crick 提出了概括遗传信息从一种分子传向另一种分子的理论 中心法则 （Central dogma）： DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 这个由 DNA 决定 RNA 分子的碱基顺序又由 RNA 决定蛋白质分子的氨基酸顺序的 理论称为中心法则。 在某些情况下 RNA 也是重要的遗传物质，如在 RNA 病毒中，RNA 是遗传信息的携 带者，具有自我复制的能力，并同时作为 mRNA，指导病毒蛋白质的生物合成。在致癌 RNA 病毒中，RNA 在逆转录酶的作用下，以逆转录（reverse transcription）的方式将遗 传信息 RNA 传递给 DNA 分子。 因此，1971 年，Crick 对中心法则作了进一步补正与完善。修改的中心法则如图 10-1 所表示。 RNA 蛋白质 翻 译 D N A 复 制 逆 转 录 转 录 复制 图 10-1 中心法则 图中实线表示遗传信息的一般流向，虚线表示特殊的流向情况。这个中心法则揭示 了核酸与蛋白质合成之间的密切联系和共同规律。 遗传信息的传递和表达主要通过复制、转录和翻译进行。复制（replication）是指以 原来 DNA 分子为模板，合成出相同 DNA 分子的过程；转录（transcription）是以 DNA 分子为模板合成出与其核苷酸顺序相对应的 RNA 的过程；翻译（translation）是在由 rRNA 和蛋白质组成的核糖核蛋白体（简称核糖体）上，以 mRNA 为模板，根据每 3 个相邻核 苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由 tRNA 运送活化的氨基酸，GTP 提供所需能
量，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程 第一节DNA的生物合成 DNA分子是由两条多核苷酸链组成的，它可以在生物体内进行合成作用。合成作用 进行时，需要有一条模板链指导多核苷酸链合成中核苷酸的排列顺序。以DNA作为模板 指导的DNA合成作用，复制出新的DNA分子，如此将DNA携带的信总传递给子代DNA DNA的合成也能以RNA为模板，反转录合成DNA分子，这种反转录合成常见于RNA 病毒。环境因素可以造成DNA结构发生损伤，损伤的DNA可进行修复((repair)合成， 即校正错误的序列，继续进行正确的合成反应，以保持遗传信息的稳定性。 一、半保留复制 DNA呈双股螺旋结构，这样的结构对于维持遗传物质的稳定性和复制的准确性都是 极为重要的。两条链是严格遵循AT和 C碱基配X 新形成的氢健联合在一起，这两条 链是互补的。一条链上的核苷酸顺序决定另一条链核苷酸排列顺序。Watson和crick提出 DNA双螺旋结构模型时推测，在DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先行解旋和分开，然 后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链（图10-2）。这 样，从亲代DNA的分子可以精确地复制成2个子代DNA分子。每个子代DNA分子中， 有一条链是从亲代 DNA来的，另一条则是新形成的，这叫做 半保留复制 replication)(图10- 与此时也有人提 全保留复制方式，即复制后亲代DNA的两 条链不变，子代DNA的两条链都是新合成的。I957年Meselson及Stahl通过实验证实了 半保留复制的模式。 294
294 量，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。 第一节 DNA 的生物合成 DNA 分子是由两条多核苷酸链组成的，它可以在生物体内进行合成作用。合成作用 进行时，需要有一条模板链指导多核苷酸链合成中核苷酸的排列顺序。以 DNA 作为模板 指导的DNA合成作用，复制出新的DNA分子，如此将DNA携带的信息传递给子代DNA。 DNA 的合成也能以 RNA 为模板，反转录合成 DNA 分子，这种反转录合成常见于 RNA 病毒。环境因素可以造成 DNA 结构发生损伤，损伤的 DNA 可进行修复（repair）合成， 即校正错误的序列，继续进行正确的合成反应，以保持遗传信息的稳定性。 一、半保留复制 DNA 呈双股螺旋结构，这样的结构对于维持遗传物质的稳定性和复制的准确性都是 极为重要的。两条链是严格遵循 A-T 和 G-C 碱基配对所形成的氢键联合在一起，这两条 链是互补的。一条链上的核苷酸顺序决定另一条链核苷酸排列顺序。Watson 和 crick 提出 DNA 双螺旋结构模型时推测，在 DNA 复制时，亲代 DNA 的双螺旋先行解旋和分开，然 后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链（图 10-2）。这 样，从亲代 DNA 的分子可以精确地复制成 2 个子代 DNA 分子。每个子代 DNA 分子中， 有一条链是从亲代 DNA 来的，另一条则是新形成的，这叫做半保留复制（semiconservative replication）（图 10-3）。与此同时也有人提出全保留复制方式，即复制后亲代 DNA 的两 条链不变，子代 DNA 的两条链都是新合成的。1957 年 Meselson 及 Stahl 通过实验证实了 半保留复制的模式
、亲代DNA分子 T -A -A- 4.C G- G.:-CS c-G SA-T A C- T G G ∠C-G TA- A -TA A C.S ∠G -T-A 复制桂 G 亲本链复制链 T·-A 亲本链 图1O-2胎tson和Cmck提出的DNA双螺旋复制模型 以大肠杆菌作为实验材料，在培养基中生长繁殖。首先在培养基中以1N标记的 NH,C1作为氨的唯一来源（即重培养基）。大肠杆菌在重培养基中繁殖约15代（每代约 20~30min),DNA可全部为lN所标记，然后将细菌转移到含有N标记NH,CI的培养 基（即轻培养基）中进行培养。在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用CsC1密度 梯度离心法分析DNA。实验结果表明，在重培养基中培养出的(N)DNA显示为一条 重密度带。转入轻培养基中繁殖两代。第一代得到了一条中密度带，这是由于其为(NN) 295
295 图 10-2 Watson 和 Crick 提出的 DNA 双螺旋复制模型 以大肠杆菌作为实验材料，在培养基中生长繁殖。首先在培养基中以 15N 标记的 NH4Cl 作为氮的唯一来源（即重培养基）。大肠杆菌在重培养基中繁殖约 15 代（每代约 20～30min），DNA 可全部为 15N 所标记，然后将细菌转移到含有 14N 标记 NH4Cl 的培养 基（即轻培养基）中进行培养。在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用 CsCl 密度 梯度离心法分析 DNA。实验结果表明，在重培养基中培养出的（15N）DNA 显示为一条 重密度带。转入轻培养基中繁殖两代。第一代得到了一条中密度带，这是由于其为（15N 14N）
DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为(NN) DNA及(NN)DNA。随着在轻培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度 带逐渐减弱。此实验结果符合半保留复制方式（图104）。在半保留或全保留复制方式中， DNA分子中NE 原来的亲代分子 多 二代子分子 图I0-3DNA的半保留复制 第一代子分子含有一条亲代的鼓《用黑色表示).与另一条新合成 链《用白色表示)配对。在以后的续复制过程中，原米亲代的两条链仍 然保持完整，因此总有两个分子各具有一条原来来代的链 为了证实第一代杂交分子确实是(NN)DNA,将杂交分子经1O0C加热变性，对 于变性前后的DNA分别进行CsCI密度梯度离心。结果变性前为一条中密度带，变性后 则分为两条区带，即重密度带(NDNA)及低密度带(NDNA)。这说明杂交分子中 条为N链，另一条为N链，这进一步证实了DNA的半保留复制方式。 296
296 DNA 的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为（15N 14N） DNA 及（14N 14N）DNA。随着在轻培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度 带逐渐减弱。此实验结果符合半保留复制方式（图 10-4）。在半保留或全保留复制方式中， DNA 分子中 15N 及 14N 标记链的情况是有所不同的（图 10-5）。 图 10-3 DNA 的半保留复制 第一代子分子含有一条亲代的链（用黑色表示），与另一条新合成的 链（用白色表示）配对。在以后的连续复制过程中，原来亲代的两条链仍 然保持完整，因此总有两个分子各具有一条原来亲代的链 为了证实第一代杂交分子确实是（15N 14N）DNA，将杂交分子经 100℃加热变性，对 于变性前后的 DNA 分别进行 CsCl 密度梯度离心。结果变性前为一条中密度带，变性后 则分为两条区带，即重密度带（15N-DNA）及低密度带（N 14 -DNA）。这说明杂交分子中 一条为 15N 链，另一条为 14N 链，这进一步证实了 DNA 的半保留复制方式
亲代分子 第一代子代分于 0 第二代子代分 1.0 M 19 轻密度DNA 图104N标记的DNA在N培养基中复制两代时的实验结果 (a)DNA区智的紫外吸收图 (b)光密度 N 在培养蒸中复制 亲代 在、培养燕中复制！ 子代 半保留复制 全保留复制 图I0-5半保留及全保留复制时DNA中标记链的分布 297
297 图 10-4 15N 标记的 DNA 在 14N 培养基中复制两代时的实验结果 （a）DNA 区带的紫外吸收图 （b）光密度圈 15N 15N 15 N 15N 在 15N 培养基中复制 亲代 在 15N 培养基中复制 ↓ ↓ 15N 14N 14N 15N 14N 14N 15N 15N 子代 半保留复制 全保留复制 图 10-5 半保留及全保留复制时 DNA 中标记链的分布
(一)复制的起始点与方向 D八A分子复制时，在亲代分子一个特定区域内双链打开，随之以两股链为模板复制 生成两个子代DNA双链分子。开始时，复制起始点呈现一叉形（或Y形），称之为复制 叉(replication fork)。复制进行中，复制叉乃向前移动（图10-6）。 1.复制的起始点 DNA复制要从DNA分子的特定部位开始 此特定部位称为复制起始点 (origin of replication),可以用ori表示。在原核生物中复制 复制叉 起始点常位于染色体的一个特定部位，即只有 个起始点。例如大肠杆菌染色体是一个含有4 105破基对的DNA分子，中右一段250个核 酸的片段为复制起始 通过对大肠杆菌 鼠伤寒沙门氏菌及肠道产 气杆菌等数种细菌的 oiC进行分析，得知它们的结构上有相似之处。 图10-6复制叉的结构 真核生物的染色体是在几个特定部位上进行 DNA复制的，有几个复制起始点的。酵母基因组与直核生物基因组相同，具有多个复制 起始点。例如，S erevisiae的17号染色体中约有400个起始点。在酵母的复制起始点中 至少有100~200个碱基与复制功能有关。 2.复制的方向 复制的方向可以有二种不同的机制。其一是从两个起始点开始，各以相反的单一方 向生长出一条新链，形成两个复制叉（图10-7a),例如腺病病靠DNA的复制。其二是从 个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉（图10-7b),例如质粒CoE 。其三是从 一个起 a)从两个起始点，单随 一方向生长 ,形成两个复制叉（图 10-7c)。这种方式最为 tional replication)。 生长叉 子起始点 一起始点1 新 tmmm 生长 起始点2一 ()从一个起始点，双战单一方向生长 生长 起始点 生长又 1起始点mm 1叉 )从一个起始点，双链双向生 生长 出长发 起点 2又 出长义 图1O-7DNA链复制方向的三种机制 298
298 （一）复制的起始点与方向 DNA 分子复制时，在亲代分子一个特定区域内双链打开，随之以两股链为模板复制 生成两个子代 DNA 双链分子。开始时，复制起始点呈现一叉形（或 Y 形），称之为复制 叉（replication fork）。复制进行中，复制叉乃向前移动（图 10-6）。 1．复制的起始点 DNA 复制要从 DNA 分子的特定部位开始， 此 特 定 部 位 称 为 复 制 起 始 点 （ origin of replication），可以用 ori 表示。在原核生物中复制 起始点常位于染色体的一个特定部位，即只有一 个起始点。例如大肠杆菌染色体是一个含有 4 10 6 碱基对的 DNA 分子，其中有一段 250 个核苷 酸的片段为复制起始点 oriC。通过对大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌及肠道产气杆菌等数种细菌的 oriC 进行分析，得知它们的结构上有相似之处。 真核生物的染色体是在几个特定部位上进行 DNA 复制的，有几个复制起始点的。酵母基因组与真核生物基因组相同，具有多个复制 起始点。例如，S.cerevisiae 的 17 号染色体中约有 400 个起始点。在酵母的复制起始点中 至少有 100～200 个碱基与复制功能有关。 2．复制的方向 复制的方向可以有三种不同的机制。其一是从两个起始点开始，各以相反的单一方 向生长出一条新链，形成两个复制叉（图 10-7a），例如腺病病毒 DNA 的复制。其二是从 一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉（图 10-7b），例如质粒 ColE I。其三是从一个起始点开始，沿两个相反的方向各生长出两条链，形成两个复制叉（图 10-7c）。这种方式最为常见，因此也是最重要的双向复制（bidirectional replication）。 图 10-7 DNA 链复制方向的三种机制 图10-6 复制叉的结构
以后用许多种原核生物和真核生物也证明了DNA的半保留复制。DNA的半保留复 制可以使遗传信息的传递保持相对的稳定性，这和它的遗传功能是相吻合的，说明半保 留复制具有重要的生物学意义。但是这种稳定性是相对的，在一定条件下DNA会发生损 伤，需要修复：在复制和转录中DA会有损耗，必须进行更新：在发育和分化过程中， DNA特定序列可能被修饰，刑除，扩增和重排。 (二)DNA聚合反应有关的酶及相关蛋白因子 DNA的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物的聚合反应，该过程除了需要酶的 催化之外，还需要适量的DNA为模板，RNA(或DNA)为引物和镁离子的参与。DNA 的聚合反应可以表示如下： n:dATP ndGTP DNA聚合酶 DNA+(n:+n2+ng+na)PPi mdCTp DNA,Mg nudTTP DNA合成的反应是很复杂的，催化这个反应的酶也有多种，除DNA聚合酶外，还 有RNA引物合成酶（即引发酶），DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因 子参与。现将与DNA合成有关的几种酶和相关的蛋白质因子简要介绍如下： 引物合成酶 引物合成酶亦称引发酶(primerase),此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA 作为合成DNA的引物(Primer)。催化引物RNA合成的酶对利福平(rifampicin)不敏 感，而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸作为底物，与经典的RNA 聚合酶不同。大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽，分子量为60000。 2.DNA合南 目前已知的DN A聚合酶(DNA polymerase)有多种，它们的性状和在DNA合成中 的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有3种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合醇I、Ⅱ、 Ⅲ。DNA聚合酶I最初是在1955年由Komberg在大肠杆菌内发现的，并将其高度纯化。 纯化的酶是一条单链多肽，呈球状，直径约为6.5m,是DNA直径的3倍左右。分子量 为1090O0。每个分子含一个锌原子。这个锌原子与酶的催化作用有关。DNA聚合酶】 是多功能酶，它具有5一3聚合酶，5一3外切酶及3一5外切酶的活性 它的主要功 能是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时，RNA引物切除后，填补其留下的空隙 当有底物和模板存在时，DNA聚合酶I可将脱氧核糖核苷酸逐个地加到具有3'-OH 末端的多核苷酸(RNA引物或DNA)链上形成3'，5'磷酸二脂键（图10-8）。至今己发 现的DNA聚合酸都不能从无到有开始合成DNA链，只能在已有的引物3'端游离OH 上合成延伸DNA,合成链的延伸方向为5'一3。该醇具有3'一5'核酸外切酶的活性 299
299 以后用许多种原核生物和真核生物也证明了 DNA 的半保留复制。DNA 的半保留复 制可以使遗传信息的传递保持相对的稳定性，这和它的遗传功能是相吻合的，说明半保 留复制具有重要的生物学意义。但是这种稳定性是相对的，在一定条件下 DNA 会发生损 伤，需要修复；在复制和转录中 DNA 会有损耗，必须进行更新；在发育和分化过程中， DNA 特定序列可能被修饰，删除，扩增和重排。 （二）DNA 聚合反应有关的酶及相关蛋白因子 DNA 的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物的聚合反应，该过程除了需要酶的 催化之外，还需要适量的 DNA 为模板，RNA（或 DNA）为引物和镁离子的参与。DNA 的聚合反应可以表示如下： n1dATP + n2dGTP DNA 聚合酶 + DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi n3dCTP DNA，Mg 2+ + n4dTTP DNA 合成的反应是很复杂的，催化这个反应的酶也有多种，除 DNA 聚合酶外，还 有 RNA 引物合成酶（即引发酶），DNA 连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因 子参与。现将与 DNA 合成有关的几种酶和相关的蛋白质因子简要介绍如下： 1． 引物合成酶 引物合成酶亦称引发酶 (primerase) ，此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA 作为合成 DNA 的引物（Primer）。催化引物 RNA 合成的酶对利福平（rifampicin）不敏 感，而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸作为底物，与经典的 RNA 聚合酶不同。大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽，分子量为 60 000。 2． DNA 聚合酶 目前已知的 DNA 聚合酶（DNA polymerase）有多种，它们的性状和在 DNA 合成中 的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有 3 种 DNA 聚合酶，分别称为 DNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ。DNA 聚合酶Ⅰ最初是在 1955 年由 Kornberg 在大肠杆菌内发现的，并将其高度纯化。 纯化的酶是一条单链多肽，呈球状，直径约为 6.5nm，是 DNA 直径的 3 倍左右。分子量 为 109 000。每个分子含一个锌原子。这个锌原子与酶的催化作用有关。DNA 聚合酶Ⅰ 是多功能酶，它具有 5′→3′聚合酶，5′→3′外切酶及 3′→5′外切酶的活性。它的主要功 能是对 DNA 损伤的修复，以及在 DNA 复制时，RNA 引物切除后，填补其留下的空隙。 当有底物和模板存在时，DNA 聚合酶Ⅰ可将脱氧核糖核苷酸逐个地加到具有 3′-OH 末端的多核苷酸（RNA 引物或 DNA）链上形成 3′,5′-磷酸二脂键（图 10-8）。至今已发 现的 DNA 聚合酶都不能从无到有开始合成 DNA 链，只能在已有的引物链 3′端游离-OH 上合成延伸 DNA，合成链的延伸方向为 5′→3′。该酶具有 3′→5′核酸外切酶的活性
能在3'-OH端将DNA链水解。在正常聚合条件下，3'一5'外切酶将错配的核苷酸切除 然后继续进行正常的聚合反应。3'一→5核酸外切酶被认为具有校对的功能。5 3核 外切酶的功能是由5'端水解双链DNA,切下单核苷酸或一段寡核苷酸。它可能起着切除 DNA损伤部分或将5'端RNA引物切除的作用.DNA聚合酶I在细胞中担负若多种功能， 如双链缺口的填补，单股链的置换合成，具有引物的环形、线形单股链的合成。 引物储 引物链 顺 人HH HO H 图I0-8DNA聚合隋催化的DNA链廷伸反应 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶I的特性和功能有相同之处，也有区别，如表10-1所示 DA聚合酶Ⅱ是由一条分子量为1200O0的多肽链组成，它的活力很低，其生理功 能尚不清楚。可能在修复紫外光照射引起的DNA损伤中起某种作用。 表10-1大肠杆三种DNA聚合酶的性质比较 项目 DNA聚合酶DNA聚合酶 DNA聚合南I(复合物) 分子结拉 单链分子 单链分子 核心酶3个亚基，全酶22个亚基 分子量 10900 120000 400000 每个细胞所含 400 100 10-20 5”+3”聚合作用 + + + 3一5'核酸外切酶 →3”核酸外切 模板和引物 宗整的林DNA 具有引物的长单链DNA 全酶+ 具有缺口(<100个核苷酸)的双 心酶 DNA 聚合速度(37℃核苷酸min.分子) 1000 100-300 15000以上 结构基因 Pol A pol B PolC.hol E,dna N,dna,dna dna Q.hol A 300
300 能在 3′-OH 端将 DNA 链水解。在正常聚合条件下，3′→5′外切酶将错配的核苷酸切除， 然后继续进行正常的聚合反应。3′→5′核酸外切酶被认为具有校对的功能。5′→3′核酸 外切酶的功能是由 5′端水解双链 DNA，切下单核苷酸或一段寡核苷酸。它可能起着切除 DNA 损伤部分或将 5′端 RNA 引物切除的作用。DNA 聚合酶Ⅰ在细胞中担负着多种功能， 如双链缺口的填补，单股链的置换合成，具有引物的环形、线形单股链的合成。 图 10-8 DNA 聚合酶催化的 DNA 链延伸反应 DNA 聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶Ⅰ的特性和功能有相同之处，也有区别，如表 10-1 所示。 DNA 聚合酶Ⅱ是由一条分子量为 120 000 的多肽链组成，它的活力很低，其生理功 能尚不清楚。可能在修复紫外光照射引起的 DNA 损伤中起某种作用。 表 10-1 大肠杆菌三种 DNA聚合酶的性质比较 项目 DNA 聚合酶 Ⅰ DNA 聚合酶 Ⅱ DNA 聚合酶Ⅲ（复合物） 分子结构 单链分子 单链分子 核心酶 3 个亚基，全酶 22 个亚基 分子量 109 000 120 000 400 000 每个细胞所含 400 100 10~20 5′→3′聚合作用 + + + 3′→5′核酸外切酶 + + + 5′→3′核酸外切酶 + 模板和引物 完整的双链 DNA 具有引物的长单链 DNA + 全酶+ 具有缺口(<100 个核苷酸)的双链 DNA + + 核心酶+ 聚合速度（37℃核苷酸/min.分子） 1 000 100~300 15 000 以上 结构基因 Pol A pol B pol C, hol E, dna N, dna X, dna Z, dna Q, hol A
DNA聚合醇Ⅲ极为复杂，目前已知它的全酶含有10种共22个亚基组分和锌原子 其组成是a2,02t2Y26262x2中2B4如表10-2所示。其中a亚基的分子量为132000， 具有5'一3'DNA聚合酶活性。a、e和0三种亚基组成全酶的核心酶（称为pOlⅢ）. E亚基具有3'外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性。核心酶本身活力较低，只 作用于带缺口的双链DNA。加上t亚基后成为二聚体，称polⅢ'，polI'就可以利用 带有引物的长单链DNA Y和6亚基则与酶功能的持续性有关 它们与8、x和电亚 基组装成Y复合体，进一步与核心醇结合，成为po*，即“天然的”聚合酶，它与 B亚基结合形成全酶。B亚基在复制起始中对引物的识别和结合有关，一且全酶结合到 DNA复制的起始部位，B亚基就被释放出来。现在一般认为，DNA聚合酶Ⅲ是原核生物 DNA复制的主要聚合靡 表10-2D4聚合酶全酶的亚基组成 亚基分子量 重基数日 13200 polII 27000 (at8) (ae ):T 1000 1000 5200l 5 3500l 2 3000 2 y复合体 15000 12000 B 37000 3.克核细胞的DNA聚合酶 在真核细胞内已发现四种DNA聚合酶，分别用a、B、Y和6表示。这四种聚合酶 的特性见表103。现在一般认为DNA聚合酸a和6的作用是复生制染色体DNA,主要的 根据是它们在细胞内活力水平的变化与DNA复制有明显的平行关系，在分裂细胞的S期 达到高峰， 聚合酵ā催化随后链的合成，而聚合酶8催化领头链的合成，它还具有3'一 外切酶的活力。DNA聚合酶B的功能主要是修复作用。DNA聚合酶Y是从线粒体中分 离得到的，推测它与线粒体DNA的复制有关。 表10-3真核生物的DNA聚合酶 DNA聚合薛 DNA聚合薛 DNA聚合藓 DNA聚合酶 B 1000-220000 45000 60000 122000 48个 1个 细胞内分布 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 酶活力占总量的百分比 -80% 10%15% 2%15% 10%0-25% 核酸外切酶活力 无 3→5 301
301 DNA 聚合酶Ⅲ极为复杂，目前已知它的全酶含有 10 种共 22 个亚基组分和锌原子， 其组成是α2ε2θ2τ2γ2δ2δ2χ2ψ2β4，如表10-2所示。其中α亚基的分子量为132 000， 具有 5′→3′DNA 聚合酶活性。a、ε和θ三种亚基组成全酶的核心酶（称为 pol Ⅲ）。 ε亚基具有 3′外切酶的校对功能，提高 DNA 复制的保真性。核心酶本身活力较低，只 作用于带缺口的双链 DNA。加上τ亚基后成为二聚体，称 pol Ⅲ′，pol Ⅲ′就可以利用 带有引物的长单链 DNA。γ和δ亚基则与酶功能的持续性有关，它们与δ′、χ和ψ亚 基组装成γ复合体，进一步与核心酶结合，成为 pol Ⅲ*，即“天然的”聚合酶Ⅲ，它与 β亚基结合形成全酶。β亚基在复制起始中对引物的识别和结合有关，一旦全酶结合到 DNA 复制的起始部位，β亚基就被释放出来。现在一般认为，DNA 聚合酶Ⅲ是原核生物 DNA 复制的主要聚合酶。 表 10-2 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成 亚基 分子量 亚基数目 其 它 名 称 α ε θ τ γ δ δ χ ψ β 132000 27000 10000 71000 52000 35000 33000 15000 12000 37000 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 polⅢ，核心酶 polⅢ′ （aεθ） （aεθ）2τ2 polⅢ* γ复合体 全酶 3． 真核细胞的 DNA 聚合酶 在真核细胞内已发现四种 DNA 聚合酶，分别用α、β、γ和δ表示。这四种聚合酶 的特性见表 10-3。现在一般认为 DNA 聚合酶α和δ的作用是复制染色体 DNA，主要的 根据是它们在细胞内活力水平的变化与 DNA 复制有明显的平行关系，在分裂细胞的 S 期 达到高峰，聚合酶α催化随后链的合成，而聚合酶δ催化领头链的合成，它还具有 3′→5 ′外切酶的活力。DNA 聚合酶β的功能主要是修复作用。DNA 聚合酶γ是从线粒体中分 离得到的，推测它与线粒体 DNA 的复制有关。 表 10-3 真核生物的 DNA聚合酶 DNA 聚合酶 α DNA 聚合酶 β DNA 聚合酶 γ DNA 聚合酶 δ 分子量 110 000~220 000 45 000 60 000 122 000 亚基数 4~8 个 1 个 1 个 1 个 细胞内分布 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 酶活力占总量的百分比 ~80% 10%~15% 2%~15% 10%~25% 核酸外切酶活力 无 无 无 3′→5′
4.DNA连接酶(DNA ligase】 DNA连接酶(DNA ligase)的作用是催化双链DNA中的切口处的相邻5'磷酸基与 3'-羟基之间形成磷酸酯键。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。 大肠杆菌的DNA连接酶要求NAD提供能量，产物是AMP和烟酰胺单核苷酸（图 10-9)。而在高等生物中，则要求ATP提供能量，产物是AMP和焦宽酸。大肠杆菌的DNA 连接酶是分子量为75000的多肽链。在哺乳动物细胞中发现至少有两种连接酶，分别称 为连接酶I和Ⅱ。连 醇I的分子量为200000，连接酶Ⅱ为8500。 连接酶I主要在 在繁殖的细胞中起作用。连接酶Ⅱ则在停止分裂的细胞中起作用。DNA连接酶在DNA 复制、修复、重组中均起重要作用。 E+ATp(成NAD+)===EAMD+Pp.(或NMN E-AMP+.5'DNA= E+AMP.-5'-DNA DNA-3-OH+AMP-@-5'-I DNA-3 -0.5'-DNA+AM DNA-3'-OH+-5'-DNA+ATP (B NAD)-DNA-3'-0-5'-DNA+AMP+PP,NMN) 图1O-9DNA连接酶催化反应的机理 5.拓扑异构酶 生物体内DNA分子通常处于超螺旋状态 而DNA的许多生物功能需要解开双链才 能进行。拓扑异构酶(topoisomerase)就是催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，它可 分为拓扑异构酶I和拓扑异构酶Ⅱ（也称为旋转酶，gyrase)。I型酶可使双链DNA分子 中的一条链发生断裂和再连接，反应不需要提供能量，它们主要集中在活性转录区，同 转录有关。Ⅱ型酶能使DNA两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋时需要由 ATP经供能量 个 石扑异构酶Ⅱ的分 子1min可引入100个负超螺旋。它们主要分布 染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。拓扑异构酶】可减少负超螺旋：拓扑异构 酶Ⅱ可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的拓扑结构。拓扑异构酶在重组、修复 和DNA的其它转变方面起者重要的作用。 解螺旋酶(helic. SC)类能通过水解ATP将DNA的两条链打开。AP水解活力要有 单链DNA存在。大肠杆菌中的rp蛋白（©p基因的产物）就是这样一种醇。由分子量 为65000的一条多肽链组成。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。 7.其它蛋白因子 (1)单链结合蛋白(ingl strand DNA-bindin otein,SSB),它的功能是稳定已被 解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸南 (2)引发前体(preprimosome),它是由6种蛋白质即dnaB、dnmC、n、n'、n和 i组成。引发前体再与RNA引物合成酶（引发酶）结合，组装成引发体(primosome)。 引发体结合到随后链的模板上，具有识别合成起始位点的功能，可以沿模板链5一3'方 向移动，移动到一定位置上即可以引发RNA引物的合成。 (三)DNA的复制过程 DNA的复制按一定的规律进行，双螺旋DNA是边解开边合成新链的。复制从特定 302
302 4． DNA 连接酶（DNA ligase） DNA 连接酶（DNA ligase）的作用是催化双链 DNA 中的切口处的相邻 5′-磷酸基与 3′-羟基之间形成磷酸酯键。但是它不能将两条游离的 DNA 单链连接起来。 大肠杆菌的 DNA 连接酶要求 NAD +提供能量，产物是 AMP 和烟酰胺单核苷酸（图 10-9）。而在高等生物中，则要求 ATP 提供能量，产物是 AMP 和焦磷酸。大肠杆菌的 DNA 连接酶是分子量为 75 000 的多肽链。在哺乳动物细胞中发现至少有两种连接酶，分别称 为连接酶Ⅰ和Ⅱ。连接酶Ⅰ的分子量为 200 000，连接酶Ⅱ为 85 000。连接酶Ⅰ主要在正 在繁殖的细胞中起作用。连接酶Ⅱ则在停止分裂的细胞中起作用。DNA 连接酶在 DNA 复制、修复、重组中均起重要作用。 E+ATP（或 NAD +）====E AMP+PPi（或 NMN） E-AMP+○P -5′-DNA====E+AMP-○P -5′-DNA DNA-3′-OH+AMP-○P -5′-DNA====DNA-3′-O-○P -5′-DNA+AMP DNA-3′-OH+○P -5′-DNA+ATP（或 NAD +）=== DNA-3′-O-○P -5′-DNA+AMP+PPi（或 NMN） 图 10-9 DNA 连接酶催化反应的机理 5． 拓扑异构酶 生物体内 DNA 分子通常处于超螺旋状态，而 DNA 的许多生物功能需要解开双链才 能进行。拓扑异构酶（topoisomerase）就是催化 DNA 的拓扑连环数发生变化的酶，它可 分为拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱ（也称为旋转酶，gyrase）。Ⅰ型酶可使双链 DNA 分子 中的一条链发生断裂和再连接，反应不需要提供能量，它们主要集中在活性转录区，同 转录有关。Ⅱ型酶能使 DNA 两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量。一个拓扑异构酶Ⅱ的分子 1min 可引入 100 个负超螺旋。它们主要分布在 染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。拓扑异构酶Ⅰ可减少负超螺旋；拓扑异构 酶Ⅱ可引入负超螺旋，它们协同作用控制着 DNA 的拓扑结构。拓扑异构酶在重组、修复 和 DNA 的其它转变方面起着重要的作用。 6． 解螺旋酶（helicase） 解螺旋酶（helicase）类能通过水解 ATP 将 DNA 的两条链打开。ATP 水解活力要有 单链 DNA 存在。大肠杆菌中的 rep 蛋白（rep 基因的产物）就是这样一种酶。由分子量 为 65 000 的一条多肽链组成。每解开一对碱基需要水解 2 个 ATP 分子。 7． 其它蛋白因子 （1）单链结合蛋白（single strand DNA-binding protein, SSB），它的功能是稳定已被 解开的 DNA 单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 （2）引发前体（preprimosome），它是由 6 种蛋白质即 dna B、dna C、n、n′、n″和 i 组成。引发前体再与 RNA 引物合成酶（引发酶）结合，组装成引发体（primosome）。 引发体结合到随后链的模板上，具有识别合成起始位点的功能，可以沿模板链 5′→3′方 向移动，移动到一定位置上即可以引发 RNA 引物的合成。 （三）DNA 的复制过程 DNA 的复制按一定的规律进行，双螺旋 DNA 是边解开边合成新链的。复制从特定