生化实验技术专题 主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般 步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心 技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白 质、核酸、酶、 氨基酸测定的主要方法
生化实验技术专题 主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般 步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心 技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白 质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法
目录 第一节生物大分子物质的制备 第二节几类主要的生化实验技术 第三节蛋白质、核酸的检测
目录 第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几类主要的生化实验技术 第三节 蛋白质、核酸的检测
第一节生物大分子物质的制备 一般过程和原则 ·确立有效成分的测定方法 材料的选择和预处理 细胞的破碎和细胞组分分离 二.注意事项 有效成分的抽提 有效成分的纯化和浓缩 三.纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化
第一节 生物大分子物质的制备 一．一般过程和原则 二．注意事项 三．纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 •确立有效成分的测定方法 •材料的选择和预处理 •细胞的破碎和细胞组分分离 •有效成分的抽提 •有效成分的纯化和浓缩
生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 层析法 电泳法 生物组织一提取液一一粗产品 结晶 超离心法 透析和超滤 |一前处理一|一粗分级一|一细分级一 依据原理 •材料选择与处理 分子大小 ·盐析（硫酸铵盐析） •细胞破碎（机械破 •溶解度 等点电沉淀 碎、溶账和自溶、 •电荷性质 ·有机溶剂沉淀 酶解、化学处理) •吸附性质 ·离心 生物亲和力
生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤 •盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ •材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理） 生物组织→ →提取液→ →粗产品→ →结晶 •分子大小 •溶解度 •电荷性质 •吸附性质 •生物亲和力 依据原理
调整疏酸铵溶液饱和度计算表 (硫酸铵最终浓度%饱和度) 10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 每升溶液需加入固体硫酸铵的克数 0 56114144176196209243277313351390430472 6 561 662767 10 57 86118137150183216251288326 365 06 592 694 20 29 59 78 91123155189225 262 300 520 619 25 30 49 61 93125158193230 583 30 19 30 62 94127162 6 酸铵起始浓 33 12 4374 10714 2 35 31 63 94 129 40 31 63 97 132 45 32 65 99 % 50 33 66 5 33 67 60 34 69 65 34 度 70 35 75 36 98 80 77 157 90 79
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
注意事项 基本原则：防止生物分子变性、降解 1. 控制适当的pH 2.控制低温 3。注意提取过程中的溶液环境 4.防止提纯过程中丢失一些辅助因子或亚基
注意事项 基本原则：防止生物分子变性、降解 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 (mg) (U) (U/mg蛋白)》 (%) 1、 粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3
宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3
第二节几类重要的生化实验技术 层析技术 二、电泳技术 三、离心技术 四、透析和超过滤
第二节 几类重要的生化实验技术 一、层析技术 二 、电泳技术 三 、离心技术 四 、透析和超过滤
一.层析技术(chromatography) 1.层析技术一般原理 2.层析技术分类 3.常用层析技术及应用
一．层析技术（chromatography） 1．层析技术一般原理 2．层析技术分类 3．常用层析技术及应用
层析技术原理 ○层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，都是由互不 相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体）， 一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化 性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶 解度等)的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动 相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 ●混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的 分配情况，一般用分配系数(distribution coefficient,.Ka)来 描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。 物质在层析系统中的行为并不直接决定于其K，而取决于它的 有效分配系数K。ft: 某一物质在A相中的总量 K。f某一物质在B相中的总量
层析技术原理 •层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析,都是由互不 相溶的两个相组成:一是固定相(固体或吸附在固体上的液体）， 一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化 性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶 解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动 相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 •混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的 分配情况，一般用分配系数(distribution coefficient,Kd）来 描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。 •物质在层析系统中的行为并不直接决定于其Kd，而取决于它的 有效分配系数Keff : Keff = 某一物质在A相中的总量 某一物质在B相中的总量