第二章细胞生物学研究方法第二节生物化学与分子生物学技术现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的，没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。一、细胞化学技术组织化学或细胞化学染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。（一）、固定目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有：1.物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。2.化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和钱酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。（二）、显示方法1．金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。3.Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。4.联苯胺反应：过氧化物酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。5.普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝，6.Formazane反应：显示脱氢酶。7."Nadi"反应：显示细胞色素氧化酶。8.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。9．三酮反应：显示蛋白质
第二章 细胞生物学研究方法 第二节 生物化学与分子生物学技术 现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的，没有这 些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。 一、细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细 胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方 法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。 （一）、固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有： 1. 物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中 的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结 构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。 如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）、显示方法 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质 或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成 CoS 或 PbS 有色沉淀，而显示 出酶活性。 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3. Schiff 反应：细胞中的醛基可使 Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用 于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。 4. 联苯胺反应：过氧化物酶分解 H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联 苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6. Formazane 反应：显示脱氢酶。 7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 9. 茚三酮反应：显示蛋白质
二、免疫细胞化学免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescenttechnique）常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate）、罗丹明（rhodamine）等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod)，常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。三、显微光谱分析技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。四、放射自显影术放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。这种技术与电镜样品处理，则为电镜放射自显影。由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用14C和3H标记。14C和3H均为弱放射性同位素，半衰期长，14C为5730年，3H为12.5年。一般常用3H胸腺啶脱氧核（3H-TDR）来显示DNA，用3H尿啶核苷（3H-UDR）显示RNA：用3H氨基酸
二、免疫细胞化学 免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结 合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是 由浆细胞针对特定的抗原分泌的 γ 球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发 生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique）常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）、罗丹明（rhodamine） 等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存 在的部位。 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗 原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记 的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。 三、显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己 特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为 260nm，而蛋白质的则为 280nm。有的成分经 组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显 微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。 四、放射自显影术 放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和 细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性 同位素（如 14C 和 3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或 涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后 经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放 射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位 或相对定量测定。 这种技术与电镜样品处理，则为电镜放射自显影。 由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用 14C 和 3H 标记。14C 和 3H 均为弱放射性同位素，半衰期长，14C 为 5730 年，3H 为 12.5 年。一般常用 3H 胸腺嘧啶脱 氧核苷（3H-TDR）来显示 DNA，用 3H 尿嘧啶核苷（3H-UDR）显示 RNA；用 3H 氨基酸
研究蛋白质，研究多糖则用3H甘露糖、3H岩藻糖等。五、分子杂交技术分子杂交技术（molecularhybridization）是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。（一）原位杂交（insituhybridization）用来检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置（图2-21）。图2-21人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片（来自http://www.ornl.gov)（二）Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用标记的探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列
研究蛋白质，研究多糖则用 3H 甘露糖、3H 岩藻糖等。 五、分子杂交技术 分子杂交技术（molecular hybridization）是在研究 DNA 分子复性变化基础上发展起来 的一种技术。其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下， 通过氢键结合，形成 DNA-DNA，DNA-RNA 或 RNA-RNA 杂交的双链分子。这种技术可用 来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）原位杂交（in situ hybridization） 用来检测染色体上的特殊 DNA 序列。最初是使用带放射性的 DNA 探针，通过放射自 显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后， 其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置（图 2-21）。 图 2-21 人类染色体端粒 DNA 的荧光原位杂交照片(来自 http://www.ornl.gov) （二）Southern 杂交 是体外分析特异 DNA 序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核 DNA 或线粒体 DNA 切成 DNA 片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用标记的探针杂交，通过 放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列
六、PCR技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域：③4种dNTP：④TagDNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermusaquaticus）中分离出来的。此酶最适作用温度为75~80℃，但短时间在95℃下不失活。③适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。反应过程：①变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95℃）使DNA双链解离；②复性：降温（约60℃左右）退火，使引物与模板结合；③延伸：升温度至70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；④重复上述“变性一复性一一延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链DNA较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标DNA以指数级数增长，经大约20一30次循环后，扩增产物中主要是目标DNA
六、PCR 技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于在体外将微量的目标 DNA 大量 扩增，以便进行分析。 反应体系：①样品 DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约 15-20 个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板 DNA 互补区之间的区域；③4 种 dNTP；④Tag DNA 聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出来的。此酶最适作用温度为 75~80℃，但短时间在 95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体系和适量的 Mg2+。 反应过程：①变性：将反应液置于 PCR 仪中，提高温度（约 90-95℃）使 DNA 双链解 离；②复性：降温（约 60℃左右）退火，使引物与模板结合；③延伸：升温度至 70-75℃， 在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成 DNA 双链片段；④重复上述“变性—— 复性——延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链 DNA 较多，但随着反应的进行，长链 DNA 以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标 DNA 以指数级数增长，经大约 20—30 次循环后，扩增产物中主要是目标 DNA