上海交通大学：《生物技术与人类》通识课程教学资源（小论文）2013春季学期_生物疫苗.doc_大学文库

一、疫苗的种类及特点疫苗，是指为了预防、控制传染病的发生、流行，用于人体预防接种的疫苗类预防性生物制品。生物制品，是指用微生物或其毒素、酶，人或动物的血清、细胞等制备的供预防、诊断和治疗用的制剂。预防接种用的生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素。其中，由细菌制成的为菌苗：由病毒、立克次体、螺旋体制成的为疫苗，有时也统称为疫苗。疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等：当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。1] 除了常见的疫苗之外，还存在一些被动免疫制剂，如：抗毒素、抗菌血清和抗病毒血清、丙种球蛋白、特异性免疫球蛋白、免疫核糖核酸、转移因子、胸腺素、干扰素。人工主动免疫和人工被动免疫均能使机体增加抗病能力，但后者的持续时间短，主要用治疗和紧急预防。 (一)传统疫苗传统的疫苗可分为减毒疫苗、灭活疫苗、亚基疫苗。【] 1.减毒疫苗减毒活疫苗是将病原微生物（细菌和病毒）在人工条件下使其丧失致病性，但仍保留其繁衍能力和免疫原性，以此制成减毒活疫苗。将减毒品活疫苗接种于人体后，使人体产生一次亚临床感染，类似一次轻型的人工自然感染过程，从而引起与疾病类似的免疫反应，但不会发病，却可获得抵御种疾病的免疫力。它在体内的作用时间长，往往只需要接种一次，即可产生稳固的免疫力，这类疫苗有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等。 2.灭活疫苗灭活疫苗是将病原微生物（包括细菌、病毒和立克次体等）及其代谢产物用物理或化学的方法使其灭活，丧失毒力，但仍保留其免疫原性而制成的疫苗，如百日咳疫苗、流脑疫苗等。这种疫苗由于病原微生物已被杀，进入人体后不能生长繁殖，因此需要注射剂量大，注射次数多。一般注射一针后产生免疫力不高，需要注射2~3次或加强注射，才能产生较为满意的免疫力。但是，灭活疫苗的稳定性好，容易保存。 3.亚基疫苗由于有些完整细胞结构的疫苗很不理想，负作用较多，所以利用非细胞机构

一、疫苗的种类及特点疫苗，是指为了预防、控制传染病的发生、流行，用于人体预防接种的疫苗类预防性生物制品。生物制品，是指用微生物或其毒素、酶，人或动物的血清、细胞等制备的供预防、诊断和治疗用的制剂。预防接种用的生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素。其中，由细菌制成的为菌苗；由病毒、立克次体、螺旋体制成的为疫苗，有时也统称为疫苗。疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。［１］除了常见的疫苗之外，还存在一些被动免疫制剂，如：抗毒素、抗菌血清和抗病毒血清、丙种球蛋白、特异性免疫球蛋白、免疫核糖核酸、转移因子、胸腺素、干扰素。人工主动免疫和人工被动免疫均能使机体增加抗病能力，但后者的持续时间短，主要用治疗和紧急预防。（一）传统疫苗传统的疫苗可分为减毒疫苗、灭活疫苗、亚基疫苗。［１］ 1.减毒疫苗减毒活疫苗是将病原微生物（细菌和病毒）在人工条件下使其丧失致病性，但仍保留其繁衍能力和免疫原性，以此制成减毒活疫苗。将减毒品活疫苗接种于人体后，使人体产生一次亚临床感染，类似一次轻型的人工自然感染过程，从而引起与疾病类似的免疫反应，但不会发病，却可获得抵御种疾病的免疫力。它在体内的作用时间长，往往只需要接种一次，即可产生稳固的免疫力，这类疫苗有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等。 2.灭活疫苗灭活疫苗是将病原微生物（包括细菌、病毒和立克次体等）及其代谢产物用物理或化学的方法使其灭活，丧失毒力，但仍保留其免疫原性而制成的疫苗，如百日咳疫苗、流脑疫苗等。这种疫苗由于病原微生物已被杀，进入人体后不能生长繁殖，因此需要注射剂量大，注射次数多。一般注射一针后产生免疫力不高，需要注射 2～3 次或加强注射，才能产生较为满意的免疫力。但是，灭活疫苗的稳定性好，容易保存。 3.亚基疫苗由于有些完整细胞结构的疫苗很不理想，负作用较多，所以利用非细胞机构

的部分抗原亚基作为疫苗。这种亚基疫苗也是灭活疫苗，没有病毒活性，如白喉和破伤风类毒素、百日咳疫苗，还有一些从致病菌株培养物中分离得到的细菌荚膜多糖疫苗都属于亚基疫苗。亚基疫苗有提取的病原体从灭火后的菌悬液中纯化的蛋白质混合物，有纯化的单组份多糖、蛋白质，有纯化后组分和佐剂的混合物，有以适当呈递形式的纯化后组分，有多糖蛋白偶联物等。亚基疫苗的毒性较小，如果分离物质得当可以提高免疫原性，但是由于仅是部分亚基组成，对于前期研究抗原特异性提出了更高的要求。例如百日咳疫苗，经过纯化后，只含有有限的免疫原性成分，而去除脂多糖的亚单位疫苗，在消除疫苗可能引起的不良生理反应方面将是成效显著的，但哪种是肺细胞结构的百日咳疫苗的最佳成分，却难以确定。为疫苗开发带来了一定阻力。 (二)现代疫苗、理想的疫苗应具有以下特性：对任何年龄的所有个体都100%有效：一次接种可终生获得保护：不会引起有害反应：在多种条件（温度、光照、运输）下可维持稳定：易于给药，最好是口服：可无限剂量给药：价格便宜。1】传统疫苗显然很难满足理想疫苗的特性，这就要求我们利用现代生物技术对其加以改良和创新。现代疫苗利用基因工程对传统疫苗进行遗传改良，并且开创了新型疫苗，可分为遗传改良活疫苗、遗传改良亚基疫苗、抗独特型疫苗、合成多肽类疫苗、核酸疫苗。 1.遗传改良活疫苗提高疫苗的效能和安全性的一个方法，是使用活的、无害的病毒或细菌作为其他病原体的抗原携带者。这些抗原携带者被称为载体。以牛痘病毒为例。牛痘病毒作为载体有如下优点：作为天花疫苗，被证明在人体中是安全的：有表达多重免疫源的可能性：便于制备：对温度又相对好的耐受性：可通过多种途径给药。已经利用遗传重组的方法改良构建了多种携带病毒和肿瘤抗原的重组活牛痘疫苗，有几种已经进入临床试验。现已证明，构建后，病毒薄膜蛋白的金银编码产物可以正确加工，并插入被感染细胞的原生质膜。牛痘的负作用和免疫原性问题，可以通过使用减毒菌株或自然界非人类寄生痘病毒解决。【2] 2.遗传改良亚基疫苗以百日咳亚基疫苗为例。应用生物技术方法改进非细胞结构百日咳疫苗已成为从化学法到遗传法灭活百日咳毒素的转折点。化学法灭活会导致蛋白质分子因构相的部分改变或抗原特性的缺失而受损。这样的损伤会降低免疫源性

的部分抗原亚基作为疫苗。这种亚基疫苗也是灭活疫苗，没有病毒活性，如白喉和破伤风类毒素、百日咳疫苗，还有一些从致病菌株培养物中分离得到的细菌荚膜多糖疫苗都属于亚基疫苗。亚基疫苗有提取的病原体从灭火后的菌悬液中纯化的蛋白质混合物，有纯化的单组份多糖、蛋白质，有纯化后组分和佐剂的混合物，有以适当呈递形式的纯化后组分，有多糖-蛋白偶联物等。亚基疫苗的毒性较小，如果分离物质得当可以提高免疫原性，但是由于仅是部分亚基组成，对于前期研究抗原特异性提出了更高的要求。例如百日咳疫苗，经过纯化后，只含有有限的免疫原性成分，而去除脂多糖的亚单位疫苗，在消除疫苗可能引起的不良生理反应方面将是成效显著的，但哪种是肺细胞结构的百日咳疫苗的最佳成分，却难以确定。为疫苗开发带来了一定阻力。（二）现代疫苗、理想的疫苗应具有以下特性：对任何年龄的所有个体都 100%有效；一次接种可终生获得保护；不会引起有害反应；在多种条件（温度、光照、运输）下可维持稳定；易于给药，最好是口服；可无限剂量给药；价格便宜。［１］传统疫苗显然很难满足理想疫苗的特性，这就要求我们利用现代生物技术对其加以改良和创新。现代疫苗利用基因工程对传统疫苗进行遗传改良，并且开创了新型疫苗，可分为遗传改良活疫苗、遗传改良亚基疫苗、抗独特型疫苗、合成多肽类疫苗、核酸疫苗。 1.遗传改良活疫苗提高疫苗的效能和安全性的一个方法，是使用活的、无害的病毒或细菌作为其他病原体的抗原携带者。这些抗原携带者被称为载体。以牛痘病毒为例。牛痘病毒作为载体有如下优点：作为天花疫苗，被证明在人体中是安全的；有表达多重免疫源的可能性；便于制备；对温度又相对好的耐受性；可通过多种途径给药。已经利用遗传重组的方法改良构建了多种携带病毒和肿瘤抗原的重组活牛痘疫苗，有几种已经进入临床试验。现已证明，构建后，病毒薄膜蛋白的金银编码产物可以正确加工，并插入被感染细胞的原生质膜。牛痘的负作用和免疫原性问题，可以通过使用减毒菌株或自然界非人类寄生痘病毒解决。［２］ 2.遗传改良亚基疫苗以百日咳亚基疫苗为例。应用生物技术方法改进非细胞结构百日咳疫苗已成为从化学法到遗传法灭活百日咳毒素的转折点。化学法灭活会导致蛋白质分子因构相的部分改变或抗原特性的缺失而受损。这样的损伤会降低免疫源性

通过定点突变进行遗传法脱毒，犹豫免疫原位点被完整地保留，可以保证稳定的重复生产具有高免疫原性的无毒突变蛋白。 3抗独特型抗体疫苗经分离后获得的与保护性抗体的抗原结合位点相对应的抗体成为抗独特型抗体疫苗。选择一个可识别特定免疫原保护性抗原决定簇的单克隆抗体Mab-1;然后，制备另一个与Mbb-1的独特型相匹配的单克隆抗体Mab-2。因此，Mab-2以免疫学的方式模拟了相应免疫原的保护性抗原决定簇，并由此可作为疫苗组分使用。这样，蛋白质类的原是抗原决定簇就成了可有可无的，这意味着免疫模仿并不总是存在于原子水平的。 4.合成多肽类疫苗分子模拟的另一个方式是多肽合成，这是免疫研究的一个热点。随着固相多肽合成的发展，大量可引发近似天然蛋白免疫反应的寡肽可以方便地获得。这种方式主要是根据抗体识别作用设计多肽类疫苗。[2] 5.核酸疫苗核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与第一、二代疫苗相比，核酸疫苗具有如下优势：诱导机体产生全面的免疫应答，其保护性免疫应答对不同的雅兴病原体具有交叉低于作用：安全可靠，无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用：能表达经修饰的天然抗原：可将不同抗原基因的多种重组质粒联合制备成多价核酸疫苗：既有预防作用又有治疗作用：生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。[3-6] 二、核酸疫苗的制备方法 (一)核酸疫苗研制的技术路线目的基因的选择·选择合适的真核质粒表达载体·将目的基因与表达载体重组+转染哺乳动物细胞检测响应蛋白质的表达+重组体的筛选 ·疫苗接种方式与剂量的确定·疫苗接种部位的确定·动物模型的选择与免疫周期和免疫次数的确定·免疫佐剂的确定·免疫保护效果的检测（二)核酸疫苗的构建与免疫流程 1.核酸疫苗基因的获得制备核酸疫苗要获得的目的基因是鞭法保护性抗原的序列。获得途径主要有三种

通过定点突变进行遗传法脱毒，犹豫免疫原位点被完整地保留，可以保证稳定的重复生产具有高免疫原性的无毒突变蛋白。 3 抗独特型抗体疫苗经分离后获得的与保护性抗体的抗原结合位点相对应的抗体成为抗独特型抗体疫苗。选择一个可识别特定免疫原保护性抗原决定簇的单克隆抗体 Mab-1；然后，制备另一个与 Mbb-1 的独特型相匹配的单克隆抗体 Mab-2。因此，Mab-2 以免疫学的方式模拟了相应免疫原的保护性抗原决定簇，并由此可作为疫苗组分使用。这样，蛋白质类的原是抗原决定簇就成了可有可无的，这意味着免疫模仿并不总是存在于原子水平的。 4.合成多肽类疫苗分子模拟的另一个方式是多肽合成，这是免疫研究的一个热点。随着固相多肽合成的发展，大量可引发近似天然蛋白免疫反应的寡肽可以方便地获得。这种方式主要是根据抗体识别作用设计多肽类疫苗。［２］ 5.核酸疫苗核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA 或 RNA ) 直接导入动物体细胞内, 并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白, 诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目的。与第一、二代疫苗相比，核酸疫苗具有如下优势：诱导机体产生全面的免疫应答，其保护性免疫应答对不同的雅兴病原体具有交叉低于作用；安全可靠，无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用；能表达经修饰的天然抗原；可将不同抗原基因的多种重组质粒联合制备成多价核酸疫苗；既有预防作用又有治疗作用；生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。［３－６］二、核酸疫苗的制备方法（一）核酸疫苗研制的技术路线目的基因的选择选择合适的真核质粒表达载体将目的基因与表达载体重组转染哺乳动物细胞检测响应蛋白质的表达重组体的筛选疫苗接种方式与剂量的确定疫苗接种部位的确定动物模型的选择与免疫周期和免疫次数的确定免疫佐剂的确定免疫保护效果的检测（二）核酸疫苗的构建与免疫流程 1.核酸疫苗基因的获得制备核酸疫苗要获得的目的基因是鞭法保护性抗原的序列。获得途径主要有三种

(1)亚单位疫苗的编码基因作为核酸疫苗的目的基因。病原体的蛋白质、糖蛋白或脂蛋白分子是病原体的亚单位成分。将这类亚单位分子纯化出来并将编码这类分子的基因与真核基因表达质粒重组是核酸疫苗研制的有效途径。 (2)将多肽合成疫苗的核算推导序列作为核酸疫苗的目的基因。 (3)从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及其编码基因。目的基因的制备方法又cDNA文库法（用抗血清做探针从文库中筛选目的基因)、PCR法与化学合成已知序列呃目的基因、基因文库法三种。此处就不具体说明了。【] 2.载体的选择载体分为克隆载体和表达载体两类。常用的克隆载体有质粒、噬菌体、黏粒三种。表达载体又原核与真核之分，其中原核表达载体主要是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌三种。真核表达载体有酵母菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞三种。[2] 对核酸疫苗而言，表达载体必须是哺乳动物细胞。[] 3.抗原基因与载体的链接根据所获得的目的基因和选择的载体不同，选择不同的限制性内切酶进行酶切并连接。 4.重组DNA分子导入哺乳动物细胞目前常用的方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体介导的基因转移法三种。【2] 5.重主子的筛选与鉴定可利用抗性筛选和蓝白斑法共同鉴定。 6.体外哺乳动物细胞中抗原表达的检测分蛋白水平监测和核酸水平检测两种。蛋白水平检测方法有免疫沉淀法、 Western杂交法、ELISA法三种，核算水平检测方法有Northern杂交法、逆转录 PCR法两种。] 7疫苗接种方式与部位的确定核酸疫苗的免疫接种方式又四种：肌内注射法，基因枪注射法，黏膜表层涂布法，静脉注射法。 8动物模型的选择根据不同疫苗可以选择不同动物模型。常见的有小鼠模型、兔子模型。禽流感核酸疫苗常用禽类模型。但由于核酸疫苗在大型动物和小型动物间有细微差别，也有使用大型动物为模型的选择方式。] 9.免疫接种剂量、免疫周期和免疫次数的确定核酸疫苗的接种剂量取决于能够诱发免疫应答反应的最低剂量

（1）亚单位疫苗的编码基因作为核酸疫苗的目的基因。病原体的蛋白质、糖蛋白或脂蛋白分子是病原体的亚单位成分。将这类亚单位分子纯化出来并将编码这类分子的基因与真核基因表达质粒重组是核酸疫苗研制的有效途径。（2）将多肽合成疫苗的核算推导序列作为核酸疫苗的目的基因。（3）从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及其编码基因。目的基因的制备方法又 cDNA 文库法（用抗血清做探针从文库中筛选目的基因）、PCR 法与化学合成已知序列呃目的基因、基因文库法三种。此处就不具体说明了。［２］ 2.载体的选择载体分为克隆载体和表达载体两类。常用的克隆载体有质粒、噬菌体、黏粒三种。表达载体又原核与真核之分，其中原核表达载体主要是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌三种。真核表达载体有酵母菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞三种。［２］对核酸疫苗而言，表达载体必须是哺乳动物细胞。［２］ 3.抗原基因与载体的链接根据所获得的目的基因和选择的载体不同，选择不同的限制性内切酶进行酶切并连接。 4.重组 DNA 分子导入哺乳动物细胞目前常用的方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体介导的基因转移法三种。［２］ 5.重主子的筛选与鉴定可利用抗性筛选和蓝白斑法共同鉴定。 6.体外哺乳动物细胞中抗原表达的检测分蛋白水平监测和核酸水平检测两种。蛋白水平检测方法有免疫沉淀法、 Western 杂交法、ELISA 法三种，核算水平检测方法有 Northern 杂交法、逆转录 PCR 法两种。［２］ 7.疫苗接种方式与部位的确定核酸疫苗的免疫接种方式又四种：肌内注射法，基因枪注射法，黏膜表层涂布法，静脉注射法。 8.动物模型的选择根据不同疫苗可以选择不同动物模型。常见的有小鼠模型、兔子模型。禽流感核酸疫苗常用禽类模型。但由于核酸疫苗在大型动物和小型动物间有细微差别，也有使用大型动物为模型的选择方式。［７］ 9.免疫接种剂量、免疫周期和免疫次数的确定核酸疫苗的接种剂量取决于能够诱发免疫应答反应的最低剂量