第二章 基因操作的主要技术原理
第二章 基因操作的主要技术原理
• 核酸的凝胶电泳 • 扩增原理 • 分子杂交 • 测序
• 核酸的凝胶电泳 • 扩增原理 • 分子杂交 • 测序
•核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段，同时也是分子生物学研究方法的 技术基础
•核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段，同时也是分子生物学研究方法的 技术基础
• 基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在 电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的 差异，以及所带电荷的不同，可以通过 电泳将其混合物中的不同成分彼此分开
• 基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在 电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的 差异，以及所带电荷的不同，可以通过 电泳将其混合物中的不同成分彼此分开
• 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大 小和构型。分子量较小的DNA分子，比 分子量较大的DNA分子迁移率要快；同 等分子量的不同构型的核酸分子，构型 紧密的比松散型的开环DNA分子或线性 DNA分子迁移率要快
• 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大 小和构型。分子量较小的DNA分子，比 分子量较大的DNA分子迁移率要快；同 等分子量的不同构型的核酸分子，构型 紧密的比松散型的开环DNA分子或线性 DNA分子迁移率要快
• 凝胶电泳的分辨力： 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间
• 凝胶电泳的分辨力： 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间
•琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP） 琼脂糖
•琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP） 琼脂糖
• LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min
• LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min
• 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液； • 直接酶切
• 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液； • 直接酶切
• 琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE（TBE TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：<1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短 时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
• 琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE（TBE TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：<1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短 时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比