食品安全学实验指导 宁 喜 斌 2007 年 4 月 5 ※ 随着生活水平的提高，消费者对食品安全问题越来越重视。社会对食品安全的专 门人才数量和质量都在增加，在此背景下国内许多高校都成立了食品质量与安全 专业。《食品安全学》作为该专业的一们核心课程，不但要求学生掌握坚实的食 品安全理论知识，也要求学生具备扎实的实践技能，因此，我们组织了相关人员 编写这本实验指导，供同学们参考。 本实验指导由宁喜斌，丛健，张慧，窦勇，王璐华完成。 鉴于水平有限，以及时间较紧，书中的错误不可避免，希望使用者能够给予批评 指正，以便我们能够及时进行修正
食品安全学实验指导 宁 喜 斌 2007 年 4 月 5 ※ 随着生活水平的提高，消费者对食品安全问题越来越重视。社会对食品安全的专 门人才数量和质量都在增加，在此背景下国内许多高校都成立了食品质量与安全 专业。《食品安全学》作为该专业的一们核心课程，不但要求学生掌握坚实的食 品安全理论知识，也要求学生具备扎实的实践技能，因此，我们组织了相关人员 编写这本实验指导，供同学们参考。 本实验指导由宁喜斌，丛健，张慧，窦勇，王璐华完成。 鉴于水平有限，以及时间较紧，书中的错误不可避免，希望使用者能够给予批评 指正，以便我们能够及时进行修正
编 者 2007 年 4 月 5 ※ 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 实验二 食品中沙门氏菌的检验 实验三 酶联免疫吸附试验（ELISA） 实验四 PCR 技术快速检测副溶血弧菌 实验五 3M 大肠杆菌和大肠菌群快速检验 实验六 对硫磷在苹果中残留的分析方法 实验七 食品中药残的快速检测 5 ※ 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、 实验目的 学习食品中金黄色葡萄球菌的基本检验方法。 二、 基本原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、 肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致 病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产 生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品， 就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险， 检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素， 使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性 金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、 设备和材料
编 者 2007 年 4 月 5 ※ 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 实验二 食品中沙门氏菌的检验 实验三 酶联免疫吸附试验（ELISA） 实验四 PCR 技术快速检测副溶血弧菌 实验五 3M 大肠杆菌和大肠菌群快速检验 实验六 对硫磷在苹果中残留的分析方法 实验七 食品中药残的快速检测 5 ※ 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、 实验目的 学习食品中金黄色葡萄球菌的基本检验方法。 二、 基本原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、 肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致 病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产 生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品， 就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险， 检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素， 使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性 金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、 设备和材料
实验器材：显微镜、恒温培养箱（37℃）、冰箱、移液管（1mL、5 mL 、10mL）、 试管（15×150mm）、锥形瓶（250mL、100mL）、培养皿、L 型涂布棒、酒精 灯、接种环、试管架、试管篓、灭菌锅、小试管（3×50mm） 实验材料：污染牛奶等。 四、 培养基和试剂 胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、Baird－Prker 琼脂平板、营养肉汤、0.85％灭菌 生理盐水、兔血浆、革兰氏染色剂 五、 操作步骤 1. 检样处理： 吸取 25mL 液体样品，加入 225mL 灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液。 2. 增菌培养 1) 增菌及分离培养： 吸取 5mL 上述混悬液，接种于胰酪胨大豆肉汤 50mL 培养基内，置 36±1℃温箱 培养 24h，转种血平板和 Baird－Parker 平板，36±1℃培养 24h，挑取金黄色葡萄 球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 2) 形态观察： 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌 体较小，直径约为 0.5～1μm。 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊 生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面 光滑，周围有溶血圈。在 Baird－Parker 平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径 为 2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一 透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似 菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型 菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 3) 血浆凝固酶实验 吸取 1∶4 新鲜兔血浆 0.5mL，放入小试管中，再加入培养 24h 的金黄色葡萄球 菌肉浸液肉汤培养物 0.5mL，振荡摇匀，放 36±1℃温箱内，每半小时观察一次， 观察 6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 3. 直接计数方法 1) 吸取上述 1：10 混悬液，进行 5 倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同 浓度的稀释液 1mL，分别加入三块 Baird－Parker 平板，每个平板接种量分别为 0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌 L 棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将 平板放在 36±1℃温箱 1h，等水分蒸发后反转平皿置 36±1℃温箱培养。 2) 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选 1 个菌落，接种血 琼脂平板，36±1℃24h 培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养 法。 3) 菌落计数： 将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除 以 5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数
实验器材：显微镜、恒温培养箱（37℃）、冰箱、移液管（1mL、5 mL 、10mL）、 试管（15×150mm）、锥形瓶（250mL、100mL）、培养皿、L 型涂布棒、酒精 灯、接种环、试管架、试管篓、灭菌锅、小试管（3×50mm） 实验材料：污染牛奶等。 四、 培养基和试剂 胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、Baird－Prker 琼脂平板、营养肉汤、0.85％灭菌 生理盐水、兔血浆、革兰氏染色剂 五、 操作步骤 1. 检样处理： 吸取 25mL 液体样品，加入 225mL 灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液。 2. 增菌培养 1) 增菌及分离培养： 吸取 5mL 上述混悬液，接种于胰酪胨大豆肉汤 50mL 培养基内，置 36±1℃温箱 培养 24h，转种血平板和 Baird－Parker 平板，36±1℃培养 24h，挑取金黄色葡萄 球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 2) 形态观察： 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌 体较小，直径约为 0.5～1μm。 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊 生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面 光滑，周围有溶血圈。在 Baird－Parker 平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径 为 2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一 透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似 菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型 菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 3) 血浆凝固酶实验 吸取 1∶4 新鲜兔血浆 0.5mL，放入小试管中，再加入培养 24h 的金黄色葡萄球 菌肉浸液肉汤培养物 0.5mL，振荡摇匀，放 36±1℃温箱内，每半小时观察一次， 观察 6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 3. 直接计数方法 1) 吸取上述 1：10 混悬液，进行 5 倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同 浓度的稀释液 1mL，分别加入三块 Baird－Parker 平板，每个平板接种量分别为 0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌 L 棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将 平板放在 36±1℃温箱 1h，等水分蒸发后反转平皿置 36±1℃温箱培养。 2) 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选 1 个菌落，接种血 琼脂平板，36±1℃24h 培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养 法。 3) 菌落计数： 将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除 以 5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数
六、 实验报告 1．鉴别牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌。 2．对牛奶中含有的金黄色葡萄球菌进行计数。 5 ※ 实验二 食品中沙门氏菌的检验 一、 实验目的 学习食品中沙门氏菌的基本检测方法。 二、 基本原理 沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病 原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过 人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节， 特别是以动物、脏器为原料的食品污染机率较高。受到污染的食品，不仅直接影 响食用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些食品必须检查沙门 氏菌。 食品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时 须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。沙门氏菌在各种 选择性培养基上的菌落形态不同，这可以作为辨别沙门氏菌的一个简单方法，在 实际工作中，我们还要配合生化实验以及血清学实验来作准确的鉴定。 三、 设备和材料 实验器材：恒温培养箱（37℃、42℃）、显微镜、广口瓶（500mL）、移液管（10mL）、 锥形瓶（250mL）、培养皿、酒精灯、试管架、试管篓、灭菌锅 实验材料：污染牛奶等、沙门氏菌株 四、 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、 DHL 琼脂、HE 琼脂、WS 琼脂、SS 琼脂 五、 操作步骤 1. 前增菌和增菌： 吸取检样 25mL，加在装有 225mL 缓冲蛋白胨水的 500mL 广口瓶内，于 37℃培 养 4h，移取 10mL，转种于 100mL 氯化镁孔雀绿增菌液内，于 42℃培养 18～24h。 同时，另取 10mL，转种于 100mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于 37℃培养 18～ 24h。 2. 分离 取增菌液 1 环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个 DHL 琼脂平板、HE 琼 脂平板、WS 和 SS 琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于
六、 实验报告 1．鉴别牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌。 2．对牛奶中含有的金黄色葡萄球菌进行计数。 5 ※ 实验二 食品中沙门氏菌的检验 一、 实验目的 学习食品中沙门氏菌的基本检测方法。 二、 基本原理 沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病 原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过 人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节， 特别是以动物、脏器为原料的食品污染机率较高。受到污染的食品，不仅直接影 响食用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些食品必须检查沙门 氏菌。 食品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时 须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。沙门氏菌在各种 选择性培养基上的菌落形态不同，这可以作为辨别沙门氏菌的一个简单方法，在 实际工作中，我们还要配合生化实验以及血清学实验来作准确的鉴定。 三、 设备和材料 实验器材：恒温培养箱（37℃、42℃）、显微镜、广口瓶（500mL）、移液管（10mL）、 锥形瓶（250mL）、培养皿、酒精灯、试管架、试管篓、灭菌锅 实验材料：污染牛奶等、沙门氏菌株 四、 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、 DHL 琼脂、HE 琼脂、WS 琼脂、SS 琼脂 五、 操作步骤 1. 前增菌和增菌： 吸取检样 25mL，加在装有 225mL 缓冲蛋白胨水的 500mL 广口瓶内，于 37℃培 养 4h，移取 10mL，转种于 100mL 氯化镁孔雀绿增菌液内，于 42℃培养 18～24h。 同时，另取 10mL，转种于 100mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于 37℃培养 18～ 24h。 2. 分离 取增菌液 1 环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个 DHL 琼脂平板、HE 琼 脂平板、WS 和 SS 琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于
36±1℃分别培养 18～24h(亚硫酸铋琼脂、DHL、HE、WS、SS) 或 40～48h(BS)， 观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个 平板上的菌落特征见表 1。 表 1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利 桑那菌） 亚硫酸铋琼脂 产硫化氢菌落为黑色有金属光 泽、棕褐色或灰色，菌落周围 培养基可呈黑色或棕色；有些 菌株不产生硫化氢，形成灰绿 色的菌落，周围培养基不变 黑色有金属光泽 DHL 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌落中 心带黑色或几乎全黑色 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 带黑色 HE 琼脂 WS 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫 化氢，菌落中心黑色或几乎全 黑色 乳糖阳性的菌株为 黄色，中心黑色或几 乎全黑色；乳糖迟缓 阳性或阴性的菌株 为蓝绿色或蓝色，中 心黑色或几乎全黑 色 SS 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌株有 的菌落中心带黑色，但不如以 上培养基明显 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株，与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 黑色，但中心无黑色 形成时与大肠艾希 氏菌不能区分 六、 实验报告 1. 辨别牛奶污染菌株是否为沙门氏菌株。 2. 辨别污染牛奶的沙门氏菌株的属群。 5 ※
36±1℃分别培养 18～24h(亚硫酸铋琼脂、DHL、HE、WS、SS) 或 40～48h(BS)， 观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个 平板上的菌落特征见表 1。 表 1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利 桑那菌） 亚硫酸铋琼脂 产硫化氢菌落为黑色有金属光 泽、棕褐色或灰色，菌落周围 培养基可呈黑色或棕色；有些 菌株不产生硫化氢，形成灰绿 色的菌落，周围培养基不变 黑色有金属光泽 DHL 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌落中 心带黑色或几乎全黑色 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 带黑色 HE 琼脂 WS 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫 化氢，菌落中心黑色或几乎全 黑色 乳糖阳性的菌株为 黄色，中心黑色或几 乎全黑色；乳糖迟缓 阳性或阴性的菌株 为蓝绿色或蓝色，中 心黑色或几乎全黑 色 SS 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌株有 的菌落中心带黑色，但不如以 上培养基明显 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株，与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 黑色，但中心无黑色 形成时与大肠艾希 氏菌不能区分 六、 实验报告 1. 辨别牛奶污染菌株是否为沙门氏菌株。 2. 辨别污染牛奶的沙门氏菌株的属群。 5 ※
实验三 酶联免疫吸附试验（间接 ELISA） 一、 目的要求 1. 了解 ELISA 的基本原理，及其优缺点。 2. 掌握间接 ELISA 法的试验操作过程。 二、 基本原理 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称 ELISA）是免疫酶 技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种 新技术。ELISA 的技术原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，形成稳定的酶 标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液 参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系， 使用 ELISA 检测仪，即酶标测定仪，测定其吸收值可做出定量分析。此技术具 特异、敏感、结果半段客观，简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物 学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用。ELISA 类型繁多，国内已有市售， 可根据需要选用，按说明书操作。 三、 器材 1. 血清 兔阴性血清 2. 溶液或试剂 ⑴ 包被液（0.05mol/l,Ph9.6 的碳酸盐缓冲液）：NaCO3 1.59g, NaHCO3 2.93g, 加去离子水定容至 1000mL（加入 0.5%的甲醛，4℃可保存约 2 周），现配现用。 ⑵ PBST 洗涤剂（吐温-磷酸盐缓冲液 pH7.4）：NaCl 8g ，KH2PO4 0.2g ， Na2HPO4·12H2O 2.9g， KCl 0.2g，吐温-20 0.5mL，蒸馏水加至 100mLl。 ⑶ 磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）：分别取甲液 24.3mL，乙液 25.7mL，加去 离子水定容至 100mLl。 甲液（0.01mol/l 的柠檬酸 C6H8O7·H2O）：称取 C6H8O7·H2O19.2g，加去离子水 定容至 1000mL。 乙液（0.2mol/l 的磷酸氢二钠 Na2HPO4·12H2O）：称取 Na2HPO4·12H2O 71.7g， 加去离子水定容至 1000mLl。 ⑷ 底物溶液：40mg 邻苯二胺溶于 1000mL pH5.0 的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，临 用前加入 150μLl 30%的 H2O2,现配现用。 ⑸ 终止液 2mol/L H2SO4：吸取 10.66mL 的 98%浓 H2SO4（密度为 1.84g/mL）， 加去离子水定容至 100mL。 ⑹ 酶标二抗（山羊抗兔 Ig-HRP）稀释液：分别吸取 10mL 小牛血清和 50μL 的 Tween-20，加上述 PBS 缓冲液定容至 100mL。 3. 仪器或其他用具 聚苯乙烯微量反应板，酶标仪，吸管，橡皮吸头等，紫外 分光光度计，20μL、100μL、500μL 移液枪各一只，ELISA 试剂盒。 四．操作步骤 1.包被抗原
实验三 酶联免疫吸附试验（间接 ELISA） 一、 目的要求 1. 了解 ELISA 的基本原理，及其优缺点。 2. 掌握间接 ELISA 法的试验操作过程。 二、 基本原理 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称 ELISA）是免疫酶 技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种 新技术。ELISA 的技术原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，形成稳定的酶 标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液 参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系， 使用 ELISA 检测仪，即酶标测定仪，测定其吸收值可做出定量分析。此技术具 特异、敏感、结果半段客观，简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物 学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用。ELISA 类型繁多，国内已有市售， 可根据需要选用，按说明书操作。 三、 器材 1. 血清 兔阴性血清 2. 溶液或试剂 ⑴ 包被液（0.05mol/l,Ph9.6 的碳酸盐缓冲液）：NaCO3 1.59g, NaHCO3 2.93g, 加去离子水定容至 1000mL（加入 0.5%的甲醛，4℃可保存约 2 周），现配现用。 ⑵ PBST 洗涤剂（吐温-磷酸盐缓冲液 pH7.4）：NaCl 8g ，KH2PO4 0.2g ， Na2HPO4·12H2O 2.9g， KCl 0.2g，吐温-20 0.5mL，蒸馏水加至 100mLl。 ⑶ 磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）：分别取甲液 24.3mL，乙液 25.7mL，加去 离子水定容至 100mLl。 甲液（0.01mol/l 的柠檬酸 C6H8O7·H2O）：称取 C6H8O7·H2O19.2g，加去离子水 定容至 1000mL。 乙液（0.2mol/l 的磷酸氢二钠 Na2HPO4·12H2O）：称取 Na2HPO4·12H2O 71.7g， 加去离子水定容至 1000mLl。 ⑷ 底物溶液：40mg 邻苯二胺溶于 1000mL pH5.0 的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，临 用前加入 150μLl 30%的 H2O2,现配现用。 ⑸ 终止液 2mol/L H2SO4：吸取 10.66mL 的 98%浓 H2SO4（密度为 1.84g/mL）， 加去离子水定容至 100mL。 ⑹ 酶标二抗（山羊抗兔 Ig-HRP）稀释液：分别吸取 10mL 小牛血清和 50μL 的 Tween-20，加上述 PBS 缓冲液定容至 100mL。 3. 仪器或其他用具 聚苯乙烯微量反应板，酶标仪，吸管，橡皮吸头等，紫外 分光光度计，20μL、100μL、500μL 移液枪各一只，ELISA 试剂盒。 四．操作步骤 1.包被抗原
用 100μL 移液枪吸取用包被液稀释好的金黄色葡萄球菌抗原，沿孔壁准确滴加 100μL 至每个塑料板孔中，防止气泡产生，置 37℃过夜。 2.洗板 倒出包被液，用另一根习惯吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不 溢出板孔为宜。均匀振荡 3min ，甩出洗涤液。再加洗涤液，重复上述操作三次， 扣干。 3.加血清 用三根套有橡皮吸头的 0.2mLl 吸管，小心吸取稀释好的血清（待 检、阳性、阴性血清），准确加 100μL 于对应板孔中，第 4 孔中加 100μL 的 PBST 洗涤液，37℃放置 10min，在水池边甩出血清，洗板三次（方法同 2）。 注意：切忌溢出互混！ 4. 加酶标抗体 用吸管沿孔壁上部小心准确加入 100μL 酶标抗体（不能让血清玷污吸管），37℃ 放置 10min，同上倒空，洗涤三次。 5. 加底物 按比例加 H2O2 于配制的底物溶液中，立即用吸管吸取此种溶液，分别加于板孔 中，每孔 0.1mL。置 37℃，显色 5～15min（经常观察），待对照有明显颜色后， 立即加一滴 2mol/L H2SO4 终止反应。 6. 判断结果 肉眼观察（白色背景），阳性对照孔应明显黄色，阴性孔应无色或微黄色，待测 孔颜色深于阳性对照孔则为阳性；酶标仪测定，酶标仪测定波长取 λ=492nm（适 用于底物为 OPD）， P/N≥2.1 时阳性 ，P/N≤1.5 阴性，2.1≥P/N≥1.5 可疑阳 性，应予复查。（P/N=检测孔 OD 值-空白孔 OD 值/阴性孔 OD 值-空白孔 OD 值。） 滴加试剂量要准，且试剂不可从一孔流到另一孔中；每种试剂对应一种吸 管，不能混淆。底物溶液中的 H2O2 要临用时再加，否则，放置时间过长，影响 试验结果判定。 五．实验报告 1.结果 运用图示表现你所进行的 ELISA 的反应原理，并写出实验结果。 2.思考题 （1）ELISA 实验过程中，洗板这一步骤能否省去，为什么？ （2）酶底物溶液为什么需要现配现用？ 5 ※ 实验四 PCR 技术快速检测副溶血弧菌 一、 实验目的 1. 学习副溶血弧菌 DNA 的提取方法 2. 学习副溶血弧菌的 PCR 检测方法
用 100μL 移液枪吸取用包被液稀释好的金黄色葡萄球菌抗原，沿孔壁准确滴加 100μL 至每个塑料板孔中，防止气泡产生，置 37℃过夜。 2.洗板 倒出包被液，用另一根习惯吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不 溢出板孔为宜。均匀振荡 3min ，甩出洗涤液。再加洗涤液，重复上述操作三次， 扣干。 3.加血清 用三根套有橡皮吸头的 0.2mLl 吸管，小心吸取稀释好的血清（待 检、阳性、阴性血清），准确加 100μL 于对应板孔中，第 4 孔中加 100μL 的 PBST 洗涤液，37℃放置 10min，在水池边甩出血清，洗板三次（方法同 2）。 注意：切忌溢出互混！ 4. 加酶标抗体 用吸管沿孔壁上部小心准确加入 100μL 酶标抗体（不能让血清玷污吸管），37℃ 放置 10min，同上倒空，洗涤三次。 5. 加底物 按比例加 H2O2 于配制的底物溶液中，立即用吸管吸取此种溶液，分别加于板孔 中，每孔 0.1mL。置 37℃，显色 5～15min（经常观察），待对照有明显颜色后， 立即加一滴 2mol/L H2SO4 终止反应。 6. 判断结果 肉眼观察（白色背景），阳性对照孔应明显黄色，阴性孔应无色或微黄色，待测 孔颜色深于阳性对照孔则为阳性；酶标仪测定，酶标仪测定波长取 λ=492nm（适 用于底物为 OPD）， P/N≥2.1 时阳性 ，P/N≤1.5 阴性，2.1≥P/N≥1.5 可疑阳 性，应予复查。（P/N=检测孔 OD 值-空白孔 OD 值/阴性孔 OD 值-空白孔 OD 值。） 滴加试剂量要准，且试剂不可从一孔流到另一孔中；每种试剂对应一种吸 管，不能混淆。底物溶液中的 H2O2 要临用时再加，否则，放置时间过长，影响 试验结果判定。 五．实验报告 1.结果 运用图示表现你所进行的 ELISA 的反应原理，并写出实验结果。 2.思考题 （1）ELISA 实验过程中，洗板这一步骤能否省去，为什么？ （2）酶底物溶液为什么需要现配现用？ 5 ※ 实验四 PCR 技术快速检测副溶血弧菌 一、 实验目的 1. 学习副溶血弧菌 DNA 的提取方法 2. 学习副溶血弧菌的 PCR 检测方法
二、 基本原理 副溶血弧菌是弧菌的一种，主要存在于海洋中，是一种致病菌。人类会因进食未 煮熟的海产品或被该菌污染的食物而感染，引起食物中毒。PCR 是利用基因扩 增技术，具有特异、敏感、快速的分子生物学方法，该技术在微生物、分子流行 病学及疾病诊断灯方面的应用显示出极大的优越性。16SrDAN 具有分子大小适 中，突变率小等优点，素有"细菌化石"之称，常被用于细菌分类及分子系统发育 树的建立。 本次实验利用 16SrDAN 的通用引物，进行 PCR 扩增，来检测副溶血弧菌。 三、 设备和材料 实验器材：PCR 扩增仪、电泳仪、高速冷冻离心机、恒温培养箱（30℃）、酒 精灯、培养皿、试管（15×150mm）、接种环、离心管（1.5mL）、一次性手套、 一次性口罩、移液枪（1－10μL、10－100μL）、枪头（0.5－10μL、1－200 μL）、配套枪头盒、显微镜、载玻片、灭菌锅、试管架、试管篓 实验材料：副溶血弧菌 24h 培养物 四、 试剂 DNA 提取试剂盒、PCR 扩增试剂盒、引物（27f、1492r）、琼脂糖、EB 染色液、 DNA Marker TAE PCR 电泳缓冲液、革兰氏染色液、TCBS 培养基、3％NaCl 营养肉汤、生理 盐水 五、 操作步骤 1．培养基培养： 取副溶血弧菌 24h 培养物分别接种在 TCBS 培养基以及 3％NaCl 营养肉汤中，30℃ 培养 24h。 2．镜检： 取固体培养基上的菌体进行革兰氏染色，观察具体形态，副溶血弧菌为革兰 氏阴性菌，在油镜下观察，菌体弧状，0.5×1.5～3.0 微米，单个或偶尔联成 S 形。 3．DNA 提取： 取液体培养物进行 DNA 提取，按照 DNA 提取试剂盒说明操作。 4．DNA 扩增： 利用细菌 16SrDNA 的通用引物来进行 DNA 扩增。总体积 25μl 的反应体系中， 10μmol/L 的上下游引物各 1μL，模板 DNA1μL，Mg+1.5μL，dNTP2.5μL， Taq 酶 0.3μL，10×buffer 缓冲液 2.0μL，双蒸水 15.2μL。 引物序列为： 27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT PCR 反应条件为： 预变性 95℃3min，变性 95℃1min，退火 55℃1min，延长 72℃2min，30 个循环， 再延长 72℃10min。 5．电泳检测：
二、 基本原理 副溶血弧菌是弧菌的一种，主要存在于海洋中，是一种致病菌。人类会因进食未 煮熟的海产品或被该菌污染的食物而感染，引起食物中毒。PCR 是利用基因扩 增技术，具有特异、敏感、快速的分子生物学方法，该技术在微生物、分子流行 病学及疾病诊断灯方面的应用显示出极大的优越性。16SrDAN 具有分子大小适 中，突变率小等优点，素有"细菌化石"之称，常被用于细菌分类及分子系统发育 树的建立。 本次实验利用 16SrDAN 的通用引物，进行 PCR 扩增，来检测副溶血弧菌。 三、 设备和材料 实验器材：PCR 扩增仪、电泳仪、高速冷冻离心机、恒温培养箱（30℃）、酒 精灯、培养皿、试管（15×150mm）、接种环、离心管（1.5mL）、一次性手套、 一次性口罩、移液枪（1－10μL、10－100μL）、枪头（0.5－10μL、1－200 μL）、配套枪头盒、显微镜、载玻片、灭菌锅、试管架、试管篓 实验材料：副溶血弧菌 24h 培养物 四、 试剂 DNA 提取试剂盒、PCR 扩增试剂盒、引物（27f、1492r）、琼脂糖、EB 染色液、 DNA Marker TAE PCR 电泳缓冲液、革兰氏染色液、TCBS 培养基、3％NaCl 营养肉汤、生理 盐水 五、 操作步骤 1．培养基培养： 取副溶血弧菌 24h 培养物分别接种在 TCBS 培养基以及 3％NaCl 营养肉汤中，30℃ 培养 24h。 2．镜检： 取固体培养基上的菌体进行革兰氏染色，观察具体形态，副溶血弧菌为革兰 氏阴性菌，在油镜下观察，菌体弧状，0.5×1.5～3.0 微米，单个或偶尔联成 S 形。 3．DNA 提取： 取液体培养物进行 DNA 提取，按照 DNA 提取试剂盒说明操作。 4．DNA 扩增： 利用细菌 16SrDNA 的通用引物来进行 DNA 扩增。总体积 25μl 的反应体系中， 10μmol/L 的上下游引物各 1μL，模板 DNA1μL，Mg+1.5μL，dNTP2.5μL， Taq 酶 0.3μL，10×buffer 缓冲液 2.0μL，双蒸水 15.2μL。 引物序列为： 27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT PCR 反应条件为： 预变性 95℃3min，变性 95℃1min，退火 55℃1min，延长 72℃2min，30 个循环， 再延长 72℃10min。 5．电泳检测：
取 15μl 扩增液经 2％琼脂糖凝胶及 TAE 电泳缓冲液电泳 90min，在 EB 染色液 中染色 30min，然后漂洗，用凝胶成像仪观察结果并拍照。 六、 实验报告 观察扩增后的 DNA 条带，根据 Marker 判断其 DNA 大小。 5 ※ 实验五 3M 大肠杆菌和大肠菌群快速检验 一 实验目的 掌握利用 3M 测试片快速检测大肠杆菌的方法。 二 基本原理 Petrifilm ColiformTM Coliform 测试片含有 VRB 培养剂 (Violet Red Bile)， 一种冷水可溶性的凝胶剂和四唑翁(tetrazollium)指示剂，可增强菌落计数效 果。绝大多数 E .coli（约占 97%）能产生-葡萄糖甘酸酶与培养基中的指示剂反 应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围，表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖 的大肠菌群产生的气体，约有 95%的大肠杆菌产生，形成蓝色或深蓝上菌落并有 气泡相连接，气泡大小约为 1 个菌落直径。 AOAC 和 FDA 细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖 产酸产气。大肠菌群菌落在 Petrifilm CC 测试片上生长产酸，PH 指示剂使培养 基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群细菌。 三 设备和材料 3M 公司的 Pertrifilm。 培养箱等。 四 操作步骤 （1） 样品准备 称取或吸取食品样品，置于适宜的无菌容器内，加入适量无菌稀释液搅拌或均质 样品。 （2） 接种 将测试片放置在平坦表面处，揭起上层膜，使用吸管将 1mL 的样品垂直滴在测试 片的中央处。将上层膜缓缓盖下，避免气泡进入，切勿让上层膜直接盖回。使用 压板（平面底朝上）放置在上层膜中央处，轻轻压下，切勿扭转或滑动压板。静 止 1min 使凝胶凝固。 （3） 培养 测试片的透明的一面向上，可堆叠至 20 片，于 35℃±1℃或 37℃±1℃下培养 24h±2h（培养后的菌落在测试片上可能看不到，因为指示剂是含在金黄色葡萄 球菌检测反应片上）。将检测片移至 62℃±2℃培养箱，培养 1h4h（注意：如 果菌落需要进一步测试，检测片培养不要超过 1h）。使用无菌镊子取出圆形的
取 15μl 扩增液经 2％琼脂糖凝胶及 TAE 电泳缓冲液电泳 90min，在 EB 染色液 中染色 30min，然后漂洗，用凝胶成像仪观察结果并拍照。 六、 实验报告 观察扩增后的 DNA 条带，根据 Marker 判断其 DNA 大小。 5 ※ 实验五 3M 大肠杆菌和大肠菌群快速检验 一 实验目的 掌握利用 3M 测试片快速检测大肠杆菌的方法。 二 基本原理 Petrifilm ColiformTM Coliform 测试片含有 VRB 培养剂 (Violet Red Bile)， 一种冷水可溶性的凝胶剂和四唑翁(tetrazollium)指示剂，可增强菌落计数效 果。绝大多数 E .coli（约占 97%）能产生-葡萄糖甘酸酶与培养基中的指示剂反 应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围，表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖 的大肠菌群产生的气体，约有 95%的大肠杆菌产生，形成蓝色或深蓝上菌落并有 气泡相连接，气泡大小约为 1 个菌落直径。 AOAC 和 FDA 细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖 产酸产气。大肠菌群菌落在 Petrifilm CC 测试片上生长产酸，PH 指示剂使培养 基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群细菌。 三 设备和材料 3M 公司的 Pertrifilm。 培养箱等。 四 操作步骤 （1） 样品准备 称取或吸取食品样品，置于适宜的无菌容器内，加入适量无菌稀释液搅拌或均质 样品。 （2） 接种 将测试片放置在平坦表面处，揭起上层膜，使用吸管将 1mL 的样品垂直滴在测试 片的中央处。将上层膜缓缓盖下，避免气泡进入，切勿让上层膜直接盖回。使用 压板（平面底朝上）放置在上层膜中央处，轻轻压下，切勿扭转或滑动压板。静 止 1min 使凝胶凝固。 （3） 培养 测试片的透明的一面向上，可堆叠至 20 片，于 35℃±1℃或 37℃±1℃下培养 24h±2h（培养后的菌落在测试片上可能看不到，因为指示剂是含在金黄色葡萄 球菌检测反应片上）。将检测片移至 62℃±2℃培养箱，培养 1h4h（注意：如 果菌落需要进一步测试，检测片培养不要超过 1h）。使用无菌镊子取出圆形的
反应片，再揭开上层覆盖膜小心置入反应片。再将上层膜放下（为了使反应片与 培养胶均匀接触及避免夹带任何气泡，可用一弯曲的玻璃棒（L 玻棒）轻压检测 片）。将已置入反应片的金黄色葡萄球菌检测片培养于 35℃±1℃或 37℃±1℃， 13h。 将测试片置于平坦表面 处，揭开上层膜 使用吸管将 1mL 样液垂 直加在测试片的中央处 细心将上层膜缓慢盖下， 避免有气泡产生，切勿使 上层膜直接落下 轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的 培养面积上，切勿扭转样板 拿起压板，静止至少 1 分钟以使培养 基凝固 测试片的透明面朝上，可 堆叠至 20 片 可目视及用标准菌落计 数器或其它的照明放大 镜计数，并可参考判读卡 计算菌落数 可以分离菌落作进一步 鉴定，即掀起上层膜，由 培养胶上挑取单个菌落 图 1 3M 测试片的操作方法 四 检测结果的判读卡和计算菌落数方法 AOAC 和 FDA 细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳 糖产酸产气。大肠菌群菌落在 Pertrifilm 测试片上生长产酸，pH 指示剂使培养基
反应片，再揭开上层覆盖膜小心置入反应片。再将上层膜放下（为了使反应片与 培养胶均匀接触及避免夹带任何气泡，可用一弯曲的玻璃棒（L 玻棒）轻压检测 片）。将已置入反应片的金黄色葡萄球菌检测片培养于 35℃±1℃或 37℃±1℃， 13h。 将测试片置于平坦表面 处，揭开上层膜 使用吸管将 1mL 样液垂 直加在测试片的中央处 细心将上层膜缓慢盖下， 避免有气泡产生，切勿使 上层膜直接落下 轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的 培养面积上，切勿扭转样板 拿起压板，静止至少 1 分钟以使培养 基凝固 测试片的透明面朝上，可 堆叠至 20 片 可目视及用标准菌落计 数器或其它的照明放大 镜计数，并可参考判读卡 计算菌落数 可以分离菌落作进一步 鉴定，即掀起上层膜，由 培养胶上挑取单个菌落 图 1 3M 测试片的操作方法 四 检测结果的判读卡和计算菌落数方法 AOAC 和 FDA 细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳 糖产酸产气。大肠菌群菌落在 Pertrifilm 测试片上生长产酸，pH 指示剂使培养基