农业微生物学实验六操作流程 【实验内容】 微生物细胞数量的平板培养计数法 【实验前的准备及核对】 1、请将自带的一切物品如书包、文具、衣物、水杯等放到柜子内或边台上。 2、核对实验材料： ()土壤样品：过筛、风干的大田土或过筛新鲜的园艺土： (2)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(300mL分装于500mL三角瓶中) 或马铃薯琼脂培养基(300mL分装于500mL三角瓶中) 或高氏一号琼脂培养基(300mL分装于500mL三角瓶中) 融化后置于60~65℃烘箱中备用(1瓶/2人)： (3)试剂：5mL1%无菌重铬酸钾溶液分装在15×150试管中(1支/2人)： 或lmL无菌链霉素溶液(20mgmL)分装在1.5 mLEnpendorff管中(1支/2人)： (4)其他灭菌物品：90mL无菌水分装于300mL三角瓶中（含30~40粒玻璃珠，1瓶/2人）： 4.5mL无菌水分装于15×150试管中(4支/2人，分离细菌7支/2人)： =9cm培养皿(9套/人)： 1mL吸管(2支/2人)： 滴管（限分离放线菌，1支/2人）： (5)其他物品：天平、称量纸、药勺(1套/8人)： 记号笔(1支2人)： 玻璃刮铲（限分离放线菌，1支/2人）。 【微生物细胞数量的平板培养计数法】 6.1样品稀释液的制备： ①准确称取待测土壤样品10g,放入90mL无菌水中，手摇10mi,使微生物细胞充分分散，然后静 置1min,得10l土壤稀释液： ②在装有4.5mL无菌水的试管壁上做好101、102至10-8标记：
1 【实验内容】 微生物细胞数量的平板培养计数法 【实验前的准备及核对】 1、请将自带的一切物品如书包、文具、衣物、水杯等放到柜子内或边台上。 2、核对实验材料： （1）土壤样品：过筛、风干的大田土或过筛新鲜的园艺土； （2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（300mL 分装于 500mL 三角瓶中） 或 马铃薯琼脂培养基（300mL 分装于 500mL 三角瓶中） 或 高氏一号琼脂培养基（300mL 分装于 500mL 三角瓶中） 融化后置于 60～65℃烘箱中备用（1 瓶/ 2 人）； （3）试剂：5mL 1%无菌重铬酸钾溶液分装在 15×150 试管中（1 支/ 2 人）； 或 1mL 无菌链霉素溶液（20mg/mL）分装在 1.5mLEnpendorff 管中（1 支/ 2 人）； （4）其他灭菌物品：90mL 无菌水分装于 300mL 三角瓶中（含 30～40 粒玻璃珠，1 瓶/ 2 人）； 4.5mL 无菌水分装于 15×150 试管中（4 支/ 2 人，分离细菌 7 支/ 2 人）； Φ=9cm 培养皿（9 套/ 人）； 1mL 吸管（2 支/ 2 人）； 滴管（限分离放线菌，1 支/ 2 人）； （5）其他物品：天平、称量纸、药勺（1 套/ 8 人）； 记号笔（1 支/2 人）； 玻璃刮铲（限分离放线菌，1 支/ 2 人）。 【微生物细胞数量的平板培养计数法】 6.1 样品稀释液的制备： ① 准确称取待测土壤样品 l0g，放入 90mL 无菌水中，手摇 10min，使微生物细胞充分分散，然后静 置 1min，得 10-1 土壤稀释液； ② 在装有 4.5mL 无菌水的试管壁上做好 10-1、10-2 至 10-8 标记； 农业微生物学实验六操作流程
③用1mL无菌吸管吸取101稀释液0.5mL,移入4.5mL无菌水中，反复吹吸2~3次，让土壤悬液充 分混合均匀，得102稀释液： ④再吸取0.5mL102稀释液，移入4.5mL无菌水的试管中，反复吹吸2~3次，即成103稀释液： ⑤以此类推，连续稀释制成104、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释士壤悬液 6.2培养基平板接种：细菌、真菌和放线菌的接种培养各不相同。 6.2.1细菌平板培养计数法：选用过筛的新鲜潮湿土壤样品，并采用基内接种法。 ①每组取9在无菌培养m,并在皿底做好106、10？、108的标记： ②每个稀释度设置三个重复，用1mL无菌吸管按无菌操作要求吸取103稀释液各1mL放入标记为 108的3个平皿中：同法吸取107稀释液各mL放入标记为107的3个平皿中：再吸取105稀释液 各mL放入标记为106的3个平皿中（由高稀释度到低稀释度的顺序，可不更换吸管）： ③在9个培养皿中分别倒入45~50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（见老师演示），立即轻轻地 在台面上延一个方向摇匀，等待凝固。 6.22真菌平板培养计数法：选用过筛的新鲜潮湿土壤样品和基内接种法。 ①每组取9在无菌培养皿，并在皿底做好103、104、105标记： ②每个稀释度设置三个重复，用1mL无菌吸管按无菌操作要求吸取10~5稀释液各1mL放入标记为 105的3个平皿中：同法吸取10稀释液各mL放入标记为104的3个平皿中；再吸取103稀释液 各mL放入标记为103的3个平皿中： ③先在45一50℃左右的马铃薯琼脂培养基中加入终浓度为50umL的链毒素溶液，摇匀，尽量避免产 生过多的气泡： ④将含链霉素的培养基倒入9个己加入菌悬液的培养皿中，立即轻轻地在台面上沿一个方向迅速摇 匀，等待凝固。 6.2.3放线菌平板培养计数法：选用风干的过筛土壤样品，并采用表面接种法。 ①将45~50℃左右的高氏一号琼脂培养基，按2滴100mL的量加入1%重铬酸钾溶液，轻轻摇匀后， 尽量避免产生过多的气泡，倒平板，待凝固后在平板底部做好10一103标记： ②用1mL无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度标记的琼脂平板上，同样每个稀释度设三 个重复： ③将玻璃刮产在酒精灯上进行火焰灭菌： ④打开平板，将灭菌刮产在培养皿盖内侧冷却一会儿，然后用无菌刮铲将菌液在平板上轻轻地均匀 涂布，注意不要刮破培养基（见演示）。当更换稀释度时，必须将刮铲重新灼烧灭菌，而当由高 稀释度向低稀释度涂布时，可不重新灼烧灭菌： ⑤将涂布好的平板于桌面上放置20~30min,使菌液完全渗透入培养基内
2 ③ 用 1mL 无菌吸管吸取 10-1 稀释液 0.5mL，移入 4.5mL 无菌水中，反复吹吸 2～3 次，让土壤悬液充 分混合均匀，得 10-2 稀释液； ④ 再吸取 0.5mL 10-2 稀释液，移入 4.5mL 无菌水的试管中，反复吹吸 2～3 次，即成 l0-3 稀释液； ⑤ 以此类推，连续稀释制成 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释土壤悬液。 6.2 培养基平板接种：细菌、真菌和放线菌的接种培养各不相同。 6.2.1 细菌平板培养计数法：选用过筛的新鲜潮湿土壤样品，并采用基内接种法。 ① 每组取 9 在无菌培养皿，并在皿底做好 10-6、10-7、10-8 的标记； ② 每个稀释度设置三个重复，用 1mL 无菌吸管按无菌操作要求吸取 10-8 稀释液各 1mL 放入标记为 10-8 的 3 个平皿中；同法吸取 10-7 稀释液各 lmL 放入标记为 10-7 的 3 个平皿中；再吸取 10-6 稀释液 各 lmL 放入标记为 10-6 的 3 个平皿中（由高稀释度到低稀释度的顺序，可不更换吸管）； ③ 在 9 个培养皿中分别倒入 45～50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（见老师演示），立即轻轻地 在台面上延一个方向摇匀，等待凝固。 6.2.2 真菌平板培养计数法：选用过筛的新鲜潮湿土壤样品和基内接种法。 ① 每组取 9 在无菌培养皿，并在皿底做好 10-3、10-4、10-5 标记； ② 每个稀释度设置三个重复，用 1mL 无菌吸管按无菌操作要求吸取 10-5 稀释液各 1mL 放入标记为 10-5 的 3 个平皿中；同法吸取 10-4 稀释液各 lmL 放入标记为 10-4 的 3 个平皿中；再吸取 10-3 稀释液 各 lmL 放入标记为 10-3 的 3 个平皿中； ③ 先在 45～50℃左右的马铃薯琼脂培养基中加入终浓度为 50u/mL 的链霉素溶液，摇匀，尽量避免产 生过多的气泡； ④ 将含链霉素的培养基倒入 9 个已加入菌悬液的培养皿中，立即轻轻地在台面上沿一个方向迅速摇 匀，等待凝固。 6.2.3 放线菌平板培养计数法：选用风干的过筛土壤样品，并采用表面接种法。 ① 将 45～50℃左右的高氏一号琼脂培养基，按 2 滴/100mL 的量加入 1%重铬酸钾溶液，轻轻摇匀后， 尽量避免产生过多的气泡，倒平板，待凝固后在平板底部做好 10-5～10-3 标记； ② 用 1mL 无菌吸管吸取 0.1mL 菌液对号接种在不同稀释度标记的琼脂平板上，同样每个稀释度设三 个重复； ③ 将玻璃刮产在酒精灯上进行火焰灭菌； ④ 打开平板，将灭菌刮产在培养皿盖内侧冷却一会儿，然后用无菌刮铲将菌液在平板上轻轻地均匀 涂布，注意不要刮破培养基（见演示）。当更换稀释度时，必须将刮铲重新灼烧灭菌，而当由高 稀释度向低稀释度涂布时，可不重新灼烧灭菌； ⑤ 将涂布好的平板于桌面上放置 20～30min，使菌液完全渗透入培养基内
6.3培养及菌落计数 ①分别收集各平板，倒置于铁皮箱中，放置在28℃培养箱中培养1周： ②选择最适稀释度的三个平板，计数，记录实验结果。 6.4待测样品中微生物数量的计算： 根据所得的菌落数和含水量，按照公式计算出样品的含茵数。 - 【实验结束后的整理】 1、在规定时间内来观察、记录实验结果 2、收拾自己实验台，将使用过的各样物品归位，保持实验前的原样。 3、值日生清扫地面，擦拭桌面。 8、课后预习下一次实验，下次上实验时交上实验报告
3 6.3 培养及菌落计数： ① 分别收集各平板，倒置于铁皮箱中，放置在 28℃培养箱中培养 1 周； ② 选择最适稀释度的三个平板，计数，记录实验结果。 6.4 待测样品中微生物数量的计算： 根据所得的菌落数和含水量，按照公式计算出样品的含菌数。 【实验结束后的整理】 1、在规定时间内来观察、记录实验结果； 2、收拾自己实验台，将使用过的各样物品归位，保持实验前的原样。 3、值日生清扫地面，擦拭桌面。 8、课后预习下一次实验，下次上实验时交上实验报告