食品化学实验指导书 焦云鹏赵海雯许旖旎编 2005年7月
食品化学实验指导书 焦云鹏 赵海雯 许旖旎 编 2005 年 7 月
实验一食品中水分含量的测定 1、试验目的 ①了解烘干法的原理和测定方法 ②掌握用烘干法测定食品水分 2、实验原理 常压下测定加热干燥前后样品的重量,根据重量差即可求得样品中的水分含量 、操作步骤 在取样前将称量皿烘干,置于干燥器中冷至室温,称重(W)。取样,盖上皿盖,称重 (W1)。将取样后的称量皿开盖置于已调节到规定加热温度的烘箱内,常压烘干一定时间, 然后取出称量皿,在干燥器内放冷到室温以后再称重,重复此操作,达恒重时(前后两次称 量不超过0.5mg),记录数据(W2)。烘干前后的重量差即为水分含量。结果计算及其表示方 法为: 试样水分%=吗1吗2×100 W1-啊0 W0为称量皿恒重(g) W1为湿样品及称量皿重(g) W2为干样和称量皿重(g) 4、思考题 测水分含量过程中,干燥前后两次称量差值为多少方可认为是恒重? 实验二淀粉的显色和水解 1.淀粉的显色和水解 进一步了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法 原理 (1)淀粉与碘的反应淀粉与碘作用呈蓝色,是由于淀粉与碘作用形成了碘一淀粉的吸 附性复合物,这种复合物是由于淀粉分子的每6个葡萄糖基形成的1个螺旋圈束缚 1个碘分子,所以当受热或者淀粉被降解,都可以使淀粉螺旋圈伸展或者解体,失 去淀粉对碘的東缚,因而蓝色消失。 (2)淀粉的水解淀粉可以在酸催化下发生水解反应,其最终产物为葡萄糖,反应过程如 下 (CH12O5)m→(CH10O3)n→C12H2O1→ClH1.O 淀粉 糊精 麦芽糖葡萄糖 3.试剂和器材 试管夹、量筒、烧杯各一只、白瓷板一块、试管一支 (1)浴锅 (2)粉及0.1%溶液
实验一 食品中水分含量的测定 1、试验目的 ①了解烘干法的原理和测定方法 ②掌握用烘干法测定食品水分 2、实验原理 常压下测定加热干燥前后样品的重量，根据重量差即可求得样品中的水分含量。 3、操作步骤 在取样前将称量皿烘干，置于干燥器中冷至室温，称重（W0）。取样，盖上皿盖，称重 （W1）。将取样后的称量皿开盖置于已调节到规定加热温度的烘箱内，常压烘干一定时间， 然后取出称量皿，在干燥器内放冷到室温以后再称重，重复此操作，达恒重时（前后两次称 量不超过 0.5mg），记录数据（W2）。烘干前后的重量差即为水分含量。结果计算及其表示方 法为： W0 为称量皿恒重（g）； W1 为湿样品及称量皿重（g）； W2 为干样和称量皿重（g）。 4、思考题 测水分含量过程中，干燥前后两次称量差值为多少方可认为是恒重？ 实验二 淀粉的显色和水解 1. 淀粉的显色和水解 进一步了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2. 原理 （1） 淀粉与碘的反应 淀粉与碘作用呈蓝色，是由于淀粉与碘作用形成了碘－淀粉的吸 附性复合物，这种复合物是由于淀粉分子的每 6 个葡萄糖基形成的 1 个螺旋圈束缚 1 个碘分子，所以当受热或者淀粉被降解，都可以使淀粉螺旋圈伸展或者解体，失 去淀粉对碘的束缚，因而蓝色消失。 （2） 淀粉的水解 淀粉可以在酸催化下发生水解反应，其最终产物为葡萄糖，反应过程如 下： （C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖 3. 试剂和器材 试管夹、量筒、烧杯各一只、白瓷板一块、试管一支。 （1） 浴锅 （2） 粉及 0.1％溶液
(3)10%NaOH溶液 (4)20%H2SO4溶液 (5)10%Na2SO4溶液 (6)稀碘液 (7)班乃德试剂:取无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中,冷却后稀释至150ml;取柠 檬酸钠173g,无水Na2SO100g和600m1水共热,溶解后冷却并加水至850ml,然后 将150 mICus0溶液倒入混合既成。此试剂可长期使用。 4.操作步骤 (1)淀粉与碘的反应 ①取少量淀粉于白瓷板空内,加碘液两滴,观察颜色。 ②取试管一支,加入0.1%的淀粉6nl,碘两滴,摇匀,观察颜色变化。另取试管两支,将 此淀粉均分为三等份并编号做如下实验: 1号管在酒精灯上加热,观察颜色变化。然后冷却,又观察颜色变化 2号管加入10%NaOH溶液几滴,观察颜色变化 3号管加入乙醇几滴,观察颜色变化 记载上述实验过程和结果,并解释现象 (2)淀粉水解实验 ①取100m1小烧杯,加入0.1%淀粉15ml及20%H2SO4溶液5m1后,置于水浴锅水浴加热 至溶液呈透明状。 ②每隔2min取透明液1滴于白瓷板上做碘实验,直至不产生颜色反应为止。 ③取一支试管,加入反应液1m1,滴10%Na2CO34滴进行中和。然后加入班式试剂2m1后 于水浴加热数分钟。 记录2、3步骤的实验结果,并解释之 5.思考题 记载各实验结果并解释每一个实验现象。 试验三油脂酸价的测定 1.目的和要求 (1)初步掌握测定油脂酸价的原理和方法 (2)了解测定油脂酸价的意义 2.原理 油脂在空气中暴露过久,部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质,并且这些物质 具有刺激性气味,使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的, 常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价髙,则说明水解产生的游离脂肪酸就多 酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高,油脂的质量也 越差 3.试剂和材料 (1)锥形瓶(250m1)。 (2)量筒(50m1)。 (3)碱式滴定管(250ml)
（3） 10％NaOH 溶液 （4） 20％H2SO4 溶液 （5） 10％Na2SO4 溶液 （6） 稀碘液 （7） 班乃德试剂：取无水硫酸铜 1.74g 溶于 100ml 热水中，冷却后稀释至 150ml；取柠 檬酸钠 173g，无水 Na2SO4100g 和 600ml 水共热，溶解后冷却并加水至 850ml，然后 将 150mlCuSO4 溶液倒入混合既成。此试剂可长期使用。 4. 操作步骤 （1） 淀粉与碘的反应 ①取少量淀粉于白瓷板空内，加碘液两滴，观察颜色。 ②取试管一支，加入 0.1％的淀粉 6ml，碘两滴，摇匀，观察颜色变化。另取试管两支，将 此淀粉均分为三等份并编号做如下实验： 1 号管在酒精灯上加热，观察颜色变化。然后冷却，又观察颜色变化。 2 号管加入 10％NaOH 溶液几滴，观察颜色变化 3 号管加入乙醇几滴，观察颜色变化。 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 （2） 淀粉水解实验 ① 取 100ml 小烧杯，加入 0.1％淀粉 15ml 及 20％H2SO4 溶液 5ml 后，置于水浴锅水浴加热 至溶液呈透明状。 ②每隔 2min 取透明液 1 滴于白瓷板上做碘实验，直至不产生颜色反应为止。 ③取一支试管，加入反应液 1ml，滴 10％Na2CO33~4 滴进行中和。然后加入班式试剂 2ml 后 于水浴加热数分钟。 记录 2、3 步骤的实验结果，并解释之。 5. 思考题 记载各实验结果并解释每一个实验现象。 试验三 油脂酸价的测定 1. 目的和要求 （1） 初步掌握测定油脂酸价的原理和方法 （2） 了解测定油脂酸价的意义。 2. 原理 油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质 具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的， 常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。 酸价是指中和 1g 油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也 越差。 3. 试剂和材料 （1） 锥形瓶（250ml）。 （2） 量筒（50ml）。 （3） 碱式滴定管（250ml）
(4)花生油或者菜油 (5) 4.操作步骤 (1)准确称取1~3g菜油于250m锥形瓶中 (2)在瓶内加入乙醇一乙醚混合液50ml,充分振荡,使油脂样品完全溶解成透明溶液 待油样完全溶解后,加入1%酚酞指示剂1~2滴,立即用0.1%KOH标准溶液滴定至溶液成 微红色(放置30S内不褪色)为终点,并记录用去的KOH的体积,并按下式进行计算。 酸价=消耗KOH的毫升数×KOH标准溶液的浓度xKOH分子量 油脂样品的克数 5.思考题 (1)测定油脂酸价时,装油的锥形瓶和油样中均不得混有无机酸,这是为什么? (2)掌握纸层析对混合氨基酸进行分离和鉴定的技术。 实验四氨基酸的纸上层析 、实验目的和要求: (1)学习纸层析法的基本原理。 (2)掌握纸层析法对混合氨基酸进行分离和鉴定的技术 、实验原理: 纸层析法属于分配层析法的一种,是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维上分布大量的 亲水性羟基,因此能吸附水作为固定相,通常把有机溶剂作为流动相。将样品在滤纸上(此 点称为原点),用有机溶剂进行展层时,样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。 由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同,因而不同溶质随流动相移动的速率不等,于是 从点样的一端向另一端展开时,样品中不同溶质被分离开来,形成距原点距离不等的层析点 样品被分离后在纸层析图谱上的位置,是用比移值R来表示的 原点到层析斑点的中心距离 R e 原点到溶剂前沿的距离 在一定条件下(如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变),某物质的Rr值是一个常 数,借此可作定性分析依据。本实验只利用纸层析分离氨基酸。 三、试剂和器材 (1)层析缸(可用标本缸代替)。 (2)层析滤纸(新华一号滤纸)。 (3)喷雾器、电吹风、三角板、铅笔、毛细管(可用微量注射器代替)。 (4)氨基酸标准溶液:1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸。 (5)混合氨基酸溶液:将1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸也 按1%浓度制成混合溶液。 (6)展层剂甲:正丁醇:80%甲酸:水=15:3:2(体积分数) 展层剂乙:正丁醇:12%水:95%乙醇=13:3:3(体积分数
（4） 花生油或者菜油。 （5） 4. 操作步骤 （1） 准确称取 1~3g 菜油于 250ml 锥形瓶中。 （2） 在瓶内加入乙醇－乙醚混合液 50ml，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。 待油样完全溶解后，加入 1％酚酞指示剂 1～2 滴，立即用 0.1％KOH 标准溶液滴定至溶液成 微红色（放置 30S 内不褪色）为终点，并记录用去的 KOH 的体积，并按下式进行计算。 油脂样品的克数 消耗 的毫升数 标准溶液的浓度 分子量 酸价 KOH KOH KOH = 5. 思考题 （1） 测定油脂酸价时，装油的锥形瓶和油样中均不得混有无机酸，这是为什么？ （2） 掌握纸层析对混合氨基酸进行分离和鉴定的技术。 实验四 氨基酸的纸上层析 一、实验目的和要求： (1) 学习纸层析法的基本原理。 (2) 掌握纸层析法对混合氨基酸进行分离和鉴定的技术。 二、实验原理： 纸层析法属于分配层析法的一种，是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维上分布大量的 亲水性羟基，因此能吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品在滤纸上(此 点称为原点)，用有机溶剂进行展层时，样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。 由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，于是 从点样的一端向另一端展开时，样品中不同溶质被分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 样品被分离后在纸层析图谱上的位置，是用比移值 Rf 来表示的 Rf 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析斑点的中心距离 = 在一定条件下(如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变)，某物质的 Rf 值是一个常 数，借此可作定性分析依据。本实验只利用纸层析分离氨基酸。 三、试剂和器材： (1) 层析缸(可用标本缸代替)。 (2) 层析滤纸(新华一号滤纸)。 (3) 喷雾器、电吹风、三角板、铅笔、毛细管(可用微量注射器代替)。 (4) 氨基酸标准溶液：1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸。 (5) 混合氨基酸溶液：将 1%的甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸也 按 1%浓度制成混合溶液。 (6) 展层剂甲：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2 (体积分数) 展层剂乙：正丁醇：12%氨水：95%乙醇＝13：3：3 (体积分数)
(⑦)色剂:0.1%茚三酮一丙酮溶液(取0.lg茚三酮溶于100mL无水丙酮,贮于棕色瓶 中待用。) 图141纸上层析点样图 四、操作步骤: (1)取滤纸二张(12cm×12cm),按图要求画好平行线和样点并在样点上标号。 (2)点样用毛细管依次点上氨基酸标准样液和混合液于样点并记录各样点所点的氨 基酸。点样时一定要注意:第一,样点直径控制在3mm以内:第二,每样点需重复点3次 但每次需经干燥后方可再点,为了快速干燥,可用电吹风在较低档温度下风干。点好样的滤 纸卷成筒状,用透明胶纸黏接,要注意在卷纸筒时,两纸不能搭接。 (3)展层在层析缸内放好展层剂甲,(展层剂液面高度约1cm),将一张点好 样的滤纸小心地移入层析缸,点样端浸入展层剂甲中,要特别注意不要使样点浸入展层 剂。盖好层析缸。当看到展层剂到达画定的溶剂前沿线时,取出滤纸,用较低档温度电吹风 吹干。同时将另一张点好样的纸照上法放入层析,此纸只此一次单向层析。 将吹干的滤纸转90°,再卷筒状,用透明胶固定,放入另一个放置有展层剂 乙的层析缸内展层。展层完毕吹干。此纸则为双向层析 (4)显色将上述单向层析和双向层析的滤纸经吹干后用喷雾器把茚三酮溶液均匀地 喷在纸上(不要喷的太多),取下纸,放入65℃烘箱中显色数分钟,或用电吹风热风吹干显 色亦可 (5)计算各氨基酸的Rr 五、思考题 (1)你是怎样理解本实验为什么要设计单向层析和双向层析的 (2)本实验做单向层析时是使用展层剂甲,是否可以用展层剂乙,为什么? (3)计算各R,并说明混合氨基酸溶液中含有一些什么氨基酸? 实验五蛋白质的等电点测定 实验目的和要求 (1)初步学会测定蛋白质等电点的基本方法 (2)了解蛋白质的两性解离性质 二、实验原理: 蛋白质分子中有一定数量的自由氨基和自由羧基存在(以及一些其他酸性和碱性基
(7) 色剂：0.1%茚三酮－丙酮溶液 (取 0.1g 茚三酮溶于 100mL 无水丙酮，贮于棕色瓶 中待用。) 四、操作步骤： (1) 取滤纸二张 (12cm×12cm)，按图要求画好平行线和样点并在样点上标号。 (2) 点样 用毛细管依次点上氨基酸标准样液和混合液于样点并记录各样点所点的氨 基酸。点样时一定要注意：第一，样点直径控制在 3mm 以内；第二，每样点需重复点 3 次， 但每次需经干燥后方可再点，为了快速干燥，可用电吹风在较低档温度下风干。点好样的滤 纸卷成筒状，用透明胶纸黏接，要注意在卷纸筒时，两纸不能搭接。 (3) 展层 在层析缸内放好展层剂甲，(展层剂液面高度约 1cm)，将一张点好 样的滤纸小心地移入层析缸，点样端浸入展层剂甲中，要特别注意不要使样点浸入展层 剂。盖好层析缸。当看到展层剂到达画定的溶剂前沿线时，取出滤纸，用较低档温度电吹风 吹干。同时将另一张点好样的纸照上法放入层析，此纸只此一次单向层析。 将吹干的滤纸转 90°，再卷筒状，用透明胶固定，放入另一个放置有展层剂 乙的层析缸内展层。展层完毕吹干。此纸则为双向层析。 (4) 显色 将上述单向层析和双向层析的滤纸经吹干后用喷雾器把茚三酮溶液均匀地 喷在纸上(不要喷的太多)，取下纸，放入 65℃烘箱中显色数分钟，或用电吹风热风吹干显 色亦可。 (5) 计算各氨基酸的 Rf。 五、思考题： (1) 你是怎样理解本实验为什么要设计单向层析和双向层析的？ (2) 本实验做单向层析时是使用展层剂甲，是否可以用展层剂乙，为什么？ (3) 计算各 Rf，并说明混合氨基酸溶液中含有一些什么氨基酸？ 实验五 蛋白质的等电点测定 一、实验目的和要求： (1) 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法。 (2) 了解蛋白质的两性解离性质。 二、实验原理： 蛋白质分子中有一定数量的自由氨基和自由羧基存在(以及一些其他酸性和碱性基
团),是两性电解质。作为带电颗粒它可以在电场中移动,移动方向取决于蛋白质分子所带 的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷,既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量 又受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一p时,蛋白质游离成正、负离子的趋势相 等,即成为兼性离子( zwitterion,净电荷为0),此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点 ( isoelectric point,简写pI)。处于等电点的蛋白质颗粒,在电场中并不移动。蛋白质溶 液的p大于等电点,该蛋白质颗粒带负电荷,反之则带正电荷。不同蛋白质,等电点不同 在等电点时,蛋白质溶解度最小,容易沉淀析出。因此,可以借助在不同p溶液中的某蛋 白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。 三、试剂与器材 (1)试管及试管架。 (2)吸管与滴管 (3)100mL容量瓶和25mL锥形瓶 (4)水浴锅和温度计。 (5)1.00mol/L醋酸。 (6)0.1mol/L醋酸。 (7)1mol/L醋酸 (8)蒸馏水。 (9)5%酪蛋白醋酸钠溶液:将酪蛋白充分研磨后称量0.5g于250mL锥形瓶中,加入10mL l.00mol/L醋酸钠溶液,将锥形瓶置于50℃左右水浴,并小心转动,使酪蛋白充分溶解。然 后将瓶内酪蛋白溶液转移到100m容量瓶中,加蒸馏水至刻度。 四、操作步骤: (1)取五支同种规格的试管,编号,按表4-1顺序精确加入各种试剂,然后逐一振荡 试管,并使试管混合均匀。 (2)将上述试管静置于试管架上约15分钟后,仔细观察,比较各管的浑浊度,将观察的 结果记载于表内,并指出酪蛋白的等电点。 注:①本实验各种试剂的浓度及用量均要求很准确 ②浑浊度可用一、+、++、+++等符号表示。 表4-1蛋白质的等电点测定表 管/蒸|1.00m01 000|.00o.%酪蛋溶液浑浊度 水醋酸/m|醋酸/m醋酸/m|白溶液/mp 8.4 0.6 1.0 5.9 8.7 0.3 1.0 5.3 9.0 1.6 0 五、思考题 (1)什么叫等电点?在等电点时,蛋白质为什么容易被沉淀析出? (2)当实验结果与已知发生较大误差时,试分析其原因
团)，是两性电解质。作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带 的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量， 又受所处溶液的 pH 影响。当蛋白质溶液处于某一 pH 时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相 等，即成为兼性离子(zwitterion,净电荷为 O)，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点 (isoelectric point,简写 pI)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶 液的 pH 大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。不同蛋白质，等电点不同。 在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。因此，可以借助在不同 pH 溶液中的某蛋 白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。 三、试剂与器材： (1) 试管及试管架。 (2) 吸管与滴管。 (3) 100mL 容量瓶和 25mL 锥形瓶。 (4) 水浴锅和温度计。 (5) 1.00mol/L 醋酸。 (6) 0.1mol/L 醋酸。 (7) 1mol/L 醋酸。 (8) 蒸馏水。 (9) 5%酪蛋白醋酸钠溶液：将酪蛋白充分研磨后称量 0.5g 于 250mL 锥形瓶中，加入 10mL 1.00mol/L 醋酸钠溶液，将锥形瓶置于 50℃左右水浴，并小心转动，使酪蛋白充分溶解。然 后将瓶内酪蛋白溶液转移到 100mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。 四、操作步骤： (1) 取五支同种规格的试管，编号，按表 4－1 顺序精确加入各种试剂，然后逐一振荡 试管，并使试管混合均匀。 (2)将上述试管静置于试管架上约 15 分钟后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的 结果记载于表内，并指出酪蛋白的等电点。 注：①本实验各种试剂的浓度及用量均要求很准确。 ②浑浊度可用－、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示。 表 4－1 蛋白质的等电点测定表 试 管 号 蒸馏 水 1.00mol/L 醋酸/mL 1.00mol/L 醋酸/mL 1.00mol/L 醋酸/mL 0.1%酪蛋 白溶液/mL 溶液 pH 浑浊度 1 8.4 0.6 1.0 5.9 2 8.7 0.3 1.0 5.3 3 8.0 1.0 1.0 4.7 4 9.0 1.0 4.1 5 7.4 1.6 1.0 3.5 五、思考题： (1) 什么叫等电点？在等电点时，蛋白质为什么容易被沉淀析出？ (2) 当实验结果与已知发生较大误差时，试分析其原因
实验六蛋白质的沉淀及变性作用 实验目的和要求 1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、实验原理: 蛋白质分子带有电荷,在水溶液中,蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层,成为 稳定的亲水胶体颗粒,因而蛋白质溶液具有典型的胶体溶液的性质。这种溶液的稳定性是有 条件的,相对的,在一定的理化因素的影响下,蛋白质颗粒失去电荷,脱水而沉淀 蛋白质的沉淀反应分为两类 1、可逆的沉淀反应:这类沉淀反应中,蛋白质虽然已经沉淀析出,但蛋白质分子的内 部结构并未发生显著变化。去除引起沉淀的因素后,沉淀的蛋白质仍能溶解于原来的溶剂中, 并保持其天然性质。如大多数蛋白质的盐析作用、在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋 白质以及等电点沉淀等,均属于这类沉淀。它常用来提纯蛋白质 2、不可逆的沉淀反应:这类沉淀反映中,蛋白质分子内部结构发生重大改变,即使去 除变性因素,蛋白质也不再溶于原来的溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固、重金属离 子和某些有机酸对蛋白质的沉淀等,均属于此类。 般来说,蛋白质变性后发生沉淀现象,但沉淀的蛋白质不一定变性。 、试剂与仪器 (一)试剂 1、蛋白质溶液:5%卵清蛋白溶液或鲜鸡蛋清加九倍水搅匀 2、pH4.7乙酸一乙酸钠缓冲液 3、饱和硫酸铵溶液。 4、硫酸铵结晶粉末。 5、95%乙醇。 6、 氯乙酸溶液 7、3%硝酸银溶液。 8、0.1mol/L盐酸溶液 9、0.1mol/L氢氧化钠溶液。 10、0.05mol/L碳酸钠溶液 11、0.lmol/L乙酸溶液。 12、甲基红溶液。 (二)、仪器: 试管及试管架,移液管(lml、5m1),滤纸,漏斗 三、操作步骤: (一)、蛋白质的盐析 取5%卵清蛋白溶液5ml于试管中,再加等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置数分钟, 则析出沉淀即球蛋白。倒出少量浑浊沉淀,加少量水,观察是否溶解,并解释。 将上步管内容物过滤,向滤液中添加硫酸铵粉末直至不再溶解为止。此时析出沉淀即 清蛋白。取出部分清蛋白,加少量蒸馏水,观察沉淀是否溶解,并解释 说明:盐析时,盐的浓度不同,析出的蛋白质也不同。球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液 中析出,而清蛋白则需在饱和硫酸铵溶液中析出。生产实践中可利用这种分步盐析法分离得
实验六 蛋白质的沉淀及变性作用 一、实验目的和要求： 1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、实验原理： 蛋白质分子带有电荷，在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层，成为 稳定的亲水胶体颗粒，因而蛋白质溶液具有典型的胶体溶液的性质。这种溶液的稳定性是有 条件的，相对的，在一定的理化因素的影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应分为两类： 1、可逆的沉淀反应：这类沉淀反应中，蛋白质虽然已经沉淀析出，但蛋白质分子的内 部结构并未发生显著变化。去除引起沉淀的因素后，沉淀的蛋白质仍能溶解于原来的溶剂中， 并保持其天然性质。如大多数蛋白质的盐析作用、在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋 白质以及等电点沉淀等，均属于这类沉淀。它常用来提纯蛋白质。 2、不可逆的沉淀反应：这类沉淀反映中，蛋白质分子内部结构发生重大改变，即使去 除变性因素，蛋白质也不再溶于原来的溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固、重金属离 子和某些有机酸对蛋白质的沉淀等，均属于此类。 一般来说，蛋白质变性后发生沉淀现象，但沉淀的蛋白质不一定变性。 三、试剂与仪器： (一) 试剂： 1、蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鲜鸡蛋清加九倍水搅匀。 2、pH4.7 乙酸－乙酸钠缓冲液。 3、饱和硫酸铵溶液。 4、硫酸铵结晶粉末。 5、95%乙醇。 6、5%三氯乙酸溶液。 7、3%硝酸银溶液。 8、0.1mol/L 盐酸溶液。 9、0.1mol/L 氢氧化钠溶液。 10、0.05mol/L 碳酸钠溶液。 11、0.1mol/L 乙酸溶液。 12、甲基红溶液。 (二)、仪器： 试管及试管架，移液管(1ml、5ml)，滤纸，漏斗 三、操作步骤： (一)、蛋白质的盐析： 取 5%卵清蛋白溶液 5ml 于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟， 则析出沉淀即球蛋白。倒出少量浑浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，并解释。 将上步管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末直至不再溶解为止。此时析出沉淀即 清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解，并解释。 说明：盐析时，盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液 中析出，而清蛋白则需在饱和硫酸铵溶液中析出。生产实践中可利用这种分步盐析法分离得
到多种蛋白质。 (二)、有机酸沉淀蛋白质: 取一支试管,加入蛋白质溶液znl,再加λ1ml5%三氯乙酸溶液,振荡试管,观察沉淀 生成。放置片刻,倾出上清夜,向沉淀中加入少量水,观察沉淀是否溶解,并解释。 说明:三氯乙酸是实验室中最常见的蛋白质变性剂。终止酶反应时,除去蛋白质对测 定的干扰时,往往用三氯乙酸。此外,磺基水杨酸沉淀蛋白质也很有效。 (三)、有机溶剂沉淀蛋白质 取一支试管,加入2m1蛋白质溶液,再加入2m195%乙醇,混匀,观察沉淀的生 成 (四)、重金属离子沉淀蛋白质; 取一支试管,加入2ml蛋白质溶液,再加入1一2滴3%硝酸银溶液,振荡,观察沉淀生 成。放置片刻,倾去上清夜,加少量水,观察沉淀是否溶解,并解释。 说明:重金属离子与蛋白质结合成盐而沉淀,不再溶解。 (五)、乙醇引起的变性与沉淀 取三支试管,编号,按表5-1顺序加入试剂 表5-1乙醇沉淀试验 试管5卵清蛋白0.1mlL氢0.lmlL盐95乙醇pH4.7缓冲液 溶液(ml)氧化钠m 酸(ml) 0 0 001 0 摇匀后,观察各管变化。放置片刻,向各管内加水8ml,然后在第2,3号管中各加 滴甲基红,分别用乙酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和。观察各管颜色变化和沉淀生成情 况。每管再加0.lmol/L盐酸溶液数滴,观察沉淀溶解情况。解释各管毎步试验现象 四、思考题 1、酒精消毒的原理是什么?为什么用75%乙醇消毒而不用无水乙醇? 2、鸡蛋清可作为铅中毒或汞中毒的解毒剂,机理是什么 实验七蛋白质的颜色反应 1.目的要求 (1)学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理 (2)学习和了解一些鉴定氨基酸的特殊颜色反应及其原理 2.原理 (1)双缩脲反应当尿素加热到180℃左右时,2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双 缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩 脲 反应 NH NH, CO+ C-O-180TH2N CNHC-NH2+NH3 尿素 双缩脲
到多种蛋白质。 (二)、有机酸沉淀蛋白质： 取一支试管，加入蛋白质溶液 2ml，再加入 1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀 生成。放置片刻，倾出上清夜，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解，并解释。 说明：三氯乙酸是实验室中最常见的蛋白质变性剂。终止酶反应时，除去蛋白质对测 定的干扰时，往往用三氯乙酸。此外，磺基水杨酸沉淀蛋白质也很有效。 (三)、有机溶剂沉淀蛋白质： 取一支试管，加入 2ml 蛋白质溶液，再加入 2ml95%乙醇，混匀，观察沉淀的生 成。 (四)、重金属离子沉淀蛋白质； 取一支试管，加入 2ml 蛋白质溶液，再加入 1－2 滴 3%硝酸银溶液，振荡，观察沉淀生 成。放置片刻，倾去上清夜，加少量水，观察沉淀是否溶解，并解释。 说明：重金属离子与蛋白质结合成盐而沉淀，不再溶解。 (五)、乙醇引起的变性与沉淀： 取三支试管，编号，按表 5－1 顺序加入试剂。 表 5－1 乙醇沉淀试验 试管 号 5%卵清蛋白 溶液(ml) 0.1mol/L 氢 氧化钠(ml) 0.1mol/L 盐 酸(ml) 95%乙醇 (ml) pH4.7 缓冲液 (ml) 1 1 0 0 1 1 2 1 1 0 1 0 3 1 0 1 1 0 摇匀后，观察各管变化。放置片刻，向各管内加水 8ml，然后在第 2，3 号管中各加 1 滴甲基红，分别用乙酸溶液及 0.05mol/L 碳酸钠溶液中和。观察各管颜色变化和沉淀生成情 况。每管再加 0.1mol/L 盐酸溶液数滴，观察沉淀溶解情况。解释各管每步试验现象。 四、思考题： 1、酒精消毒的原理是什么？为什么用 75%乙醇消毒而不用无水乙醇？ 2、鸡蛋清可作为铅中毒或汞中毒的解毒剂，机理是什么 实验七 蛋白质的颜色反应 1. 目的要求 （1） 学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 （2） 学习和了解一些鉴定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。 2. 原理 （1）双缩脲反应 当尿素加热到 180℃左右时，2 分子尿素发生缩合放出 1 分子氨而形成双 缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩 脲 反应
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键,因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以 鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出,双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应,因为 凡含有肽键的物质并不都是蛋白质 (2)茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热,产生蓝紫色化合物,此反应为一切蛋白质及α-氨基酸(除脯氨 酸和羟脯氨酸)所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏,1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此,此反应广泛 用于氨基酸的定量测定 3.试剂和器材 (1)试剂 ①鸡蛋清②尿素③10%NaOH溶液④1%硫酸铜溶液⑤∽.1%茚三酮-乙醇溶液 (2)仪器试管及试管夹、酒精灯 4.操作步骤 (1)双缩脲反应 ①取一支干燥试管,加入少量尿素,用微火加热使之熔化,待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时,尿素已缩合为双缩脲并放出氨气(可由气味辨别)。待试管冷却,加入约1m10% NaOH溶液,振荡使其溶解,再加入1滴1%硫酸铜溶液。混匀后观察岀现的粉红色。 ②另取1支试管,加入稀释过的蛋清溶液2滴,再加入5滴10%NaOH溶液摇匀,然后再加 入1滴1%的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化 注意事项:加入的硫酸铜不可过量,否则会产生蓝色的氢氧化铜,从而掩盖了双缩脲反 应的粉红色。 (2)茚三酮反应 ①取1支试管,加入稀释的蛋清溶液4滴,0.1%茚三酮-乙醇溶液2滴,混匀后在小火上加 热煮沸1~2min,放置冷却,观察颜色变化 ②另取2支试管,用0.5%的酪蛋白和0.5%的甘氨酸溶液代表蛋白溶液,进行茚三酮反应, 观察颜色变化。 5.思考题通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有何认识 实验八pH值对酶活性的影响 目的要求 了解pH值对酶活的影响 2.实验原理 酶的活性受环境p影响极其显著,通常各种酶只有在一定的p范围内才表现它的 活性,一种酶表现出活性最高时的pH值,称为该酶的最适pH,低于或高于最适 pH时,酶的活力逐次降低。不同的酶最适p不同,酶的最适pH受底物和缓冲液性质的影 响 本实验主要观察p值对唾液淀粉酶的活性影响。在唾液淀粉酶的作用下,淀粉水解, 经过一系列被称为糊精的中间产物,最后生成麦芽糖和葡萄糖,糊精遇碘变红色,麦芽糖和 葡萄糖遇碘不变色。唾液淀粉酶的最适作用温度为37~40℃,最适p为6.8。偏离此最适
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以 鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为 凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 （2）茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨 酸和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1：1500000 浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛 用于氨基酸的定量测定。 3．试剂和器材 （1）试剂 ①鸡蛋清②尿素③10％NaOH 溶液④1％硫酸铜溶液⑤0.1％茚三酮-乙醇溶液 （2）仪器 试管及试管夹、酒精灯 4．操作步骤 （1）双缩脲反应 ①取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约 1mL10％ NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入 1 滴 1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。 ②另取 1 支试管，加入稀释过的蛋清溶液 2 滴，再加入 5 滴 10％NaOH 溶液摇匀，然后再加 入 1 滴 1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 注意事项：加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反 应的粉红色。 （2）茚三酮反应 ①取 1 支试管，加入稀释的蛋清溶液 4 滴，0.1％茚三酮-乙醇溶液 2 滴，混匀后在小火上加 热煮沸 1～2min，放置冷却，观察颜色变化。 ②另取 2 支试管，用 0.5％的酪蛋白和 0.5％的甘氨酸溶液代表蛋白溶液，进行茚三酮反应， 观察颜色变化。 5．思考题 通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有何认识 实验八 pH 值对酶活性的影响 1．目的要求 了解 pH 值对酶活的影响。 2．实验原理 酶的活性受环境 pH 影响极其显著，通常各种酶只有在一定的 pH 范围内才表现它的 活性，一种酶表现出活性最高时的 pH 值，称为该酶的最适 pH，低于或高于最适 pH 时，酶的活力逐次降低。不同的酶最适 pH 不同，酶的最适 pH 受底物和缓冲液性质的影 响。 本实验主要观察 pH 值对唾液淀粉酶的活性影响。在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解， 经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖，糊精遇碘变红色，麦芽糖和 葡萄糖遇碘不变色。唾液淀粉酶的最适作用温度为 37～40℃，最适 pH 为 6.8。偏离此最适
环境,酶的活性减弱 3.试剂和器材 (1)试剂 ①稀释200倍数的新鲜唾液②新配置的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液③碘化钾 碘溶液④0.zπol/磷酸氢二钠溶液⑤o.lmol/柠檬酸溶液⑥pH试纸:p5、pH5.8、pH6.8、 pH8.0 (2)仪器试管及试管夹、恒温水浴锅、移液管(10mL、2皿L各1支、5m2支)、白瓷板、 滴管、锥形瓶等 4.操作步骤 (1)取4支标有号码的5omL锥形瓶,用按表8-1添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.lmol/L 柠檬酸溶液以制备pH5.0~8.0的4种缓冲液。 表8-1pH5.0~8.0的缓冲液制备表 隹形瓶号 0.2mol/L磷酸氢二钠/mL 0.1mol/L柠檬酸/mL 5.15 4.85 5.0 6.05 3.95 234 5.8 7.72 9.72 B8试 6. (2)从4个锥形瓶中各取缓冲液3皿L,分别注入4支编好的试管中,随后于每个试管中添 加0.5%淀粉溶液2mL和稀释200倍的唾液2m。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为 lmin。将各试管内容物混匀,并依次置于37℃恒温水浴中保温。 (3)在第4管中加入唾液2min后,每隔lmin由第4管取出1滴混合液,置于白瓷板上, 加1小滴碘化钾-碘溶液,检测淀粉的水解程度。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔,从第 管起,亦均为1min。观察各试管内容物呈现的颜色,分析pH对唾液淀粉酶活性的影响 5.思考题 (1)p对酶活性有何影响?什么是酶反应的最适pH? (2)酶反应的p是否是一个常数?它与哪些因素有关?这种性质对于选择测定酶的活性条 件有什么意义? 实验九酶的激活剂和抑制剂 1.目的要求 (1)了解酶促反应的激活与抑制。 (2)学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。 2.实验原理 酶的活性常受某些物质的影响,有些物质能使酶的活性增加,称为酶的激活剂,有些物 质会使酶的活性降低,称为酶的抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性。而且 常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的,有些物质在低浓度时为某种酶的 激活剂,而在高浓度时则为该酶的抑制剂 本实验主要观察抑制剂和激活剂对唾液淀粉酶的活性影响。其中氯化钠可以作为唾液淀 粉酶的激活剂,硫酸铜为其抑制剂。值得注意的是,氯化钠达到1/3饱和度时就会抑制唾液 淀粉酶的活性。 3.试剂和器材
环境，酶的活性减弱。 3．试剂和器材 （1）试剂 ①稀释 200 倍数的新鲜唾液②新配置的溶于 0.3％氯化钠的 0.5％淀粉溶液③碘化钾- 碘溶液④0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液⑤0.1mol/L 柠檬酸溶液⑥pH 试纸：pH5、pH5.8、pH6.8、 pH8.0。 （2）仪器 试管及试管夹、恒温水浴锅、移液管（10mL、2mL 各 1 支、5mL2 支）、白瓷板、 滴管、锥形瓶等 4．操作步骤 （1）取 4 支标有号码的 50mL 锥形瓶，用按表 8-1 添加 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液和 0.1mol/L 柠檬酸溶液以制备 pH5.0～8.0 的 4 种缓冲液。 表 8-1 pH5.0～8.0 的缓冲液制备表 锥形瓶号 0.2mol/L 磷酸氢二钠/mL 0.1mol/L 柠檬酸/mL pH 1 5.15 4.85 5.0 2 6.05 3.95 5.8 3 7.72 2.28 6.8 4 9.72 0.28 8.0 （2）从 4 个锥形瓶中各取缓冲液 3mL，分别注入 4 支编好的试管中，随后于每个试管中添 加 0.5％淀粉溶液 2mL 和稀释 200 倍的唾液 2mL。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为 1min。将各试管内容物混匀，并依次置于 37℃恒温水浴中保温。 （3）在第 4 管中加入唾液 2min 后，每隔 1min 由第 4 管取出 1 滴混合液，置于白瓷板上， 加 1 小滴碘化钾-碘溶液，检测淀粉的水解程度。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔，从第 1 管起，亦均为 1min。观察各试管内容物呈现的颜色，分析 pH 对唾液淀粉酶活性的影响。 5．思考题 （1）pH 对酶活性有何影响？什么是酶反应的最适 pH？ （2）酶反应的 pH 是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶的活性条 件有什么意义？ 实验九 酶的激活剂和抑制剂 1．目的要求 （1）了解酶促反应的激活与抑制。 （2）学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。 2．实验原理 酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂，有些物 质会使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性。而且 常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的 激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。 本实验主要观察抑制剂和激活剂对唾液淀粉酶的活性影响。其中氯化钠可以作为唾液淀 粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。值得注意的是，氯化钠达到 1/3 饱和度时就会抑制唾液 淀粉酶的活性。 3．试剂和器材
