《自然科学进展》：固氮酶催化机制及化学模拟生物固氮研究进展（中国农业大学：王友绍、李季伦）

第10卷第6期 自然科学进展 200年6月 兴专题评述兴 固氮酶催化机制及化学模拟 生物固氮研究进展 王友绍①②李季伦① (①中国农业大学生物学院,农业生物技术国家重点实验室,北京10004;②菜阳农学院,莱阳265200 摘要综述了固氪酶催化机制及化学模拟生物固氮研究的最新进展和问题.根据 固氮酶在生理条件下,具有固氪和放氢双重功能的事实,认为在研究确定N2络合和 还原位点的同时,也应确定H+还原成H2的位点,才能为化学模拟生物固氮提供全 面信息,以指导化学模拟物的设计与合成;并提出组成固氮酶活性中心原子簇的 [FeS3Fe3]和[ MossE3]可能分别是N2还原和H还原位点的设想,此设想如经验证 将会简化模拟物的化学合成,可望加速实现在较温和的条件下(<300℃,<5066kPa (50atm))将N2还原成NH 关键词固氮酶铁钼辅因子催化机制化学模拟 生物固氮在自然界氮素循环中起着重要作用,据估计全球每年所固定的N2量约达2亿 吨门,为生物生长繁殖提供了大量氮素.生物固氮是由固氮微生物体内的固氮酶在常温常压 下将N2还原成NH2的2),而化学合成NH3则需要在高温(350或500℃)和高压(50662或 35464kPa1)下进行,消耗大量能源并污染大气,因此,研究固氮酶催化机制及化学模拟生物 固氮,不仅在生命科学和化学催化科学上理论意义重大,而且对农业持续发展和环境保护将会 产生深远影响.近年来,由于全世界面临能源、粮食、人口和环境等问题的挑战,生物固氮的研 究在世界各国都受到重视,其进展十分迅速.本文着重综述固氮酶的催化机制及其化学模拟 研究的新进展和存在的问题 1固氮酶的组成、结构与功能 1.1固氮酶的组成 固氮酶( Nitrogenase)是由钼铁蛋白和铁蛋白组成的复合体,这两种蛋白单独存在时都不 呈现固氮酶活性,只有两者形成复合体后才具有还原氮的能力.固氮酶对氧极敏感,浓度大于 1×10的O2就使其失活.钼铁蛋白也称组分1或二氮酶( Dinitrogenase);铁蛋自也称组分2 199908-17收稿,1999-11-22收修改稿 国家自然科学基金(批准号:39900060农业生物技术国家重点实验室和国家博上后科学基金资助项目 1)I atm= 101.325 kPa C1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicpUblishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net

第 卷 第 期 自然科学进 展 洲 年 月 , 专题评 述 固 氮 酶催 化 机 制 及化 学模拟 生 物 固 氮研 究 进展 关 王 友绍 ①② 李季伦 ① ①中国农业 大学生 物学 院 , 农业 生 物技术国家重 点 实 验 室 , 北京 《刀为 ②莱 阳农学 院 , 莱 阳 摘要 综述 了固氮酶催 化机制及 化 学模拟 生物 固氮研 究的最 新进 展 和 问题 根据 固氮酶在生理 条件下 , 具有 固氮和放 氢双 重 功能 的事实 , 认 为在研 究确定 姚 络 合 和 还 原位 点的同时 , 也应确定 还 原 成 姚 的位 点 , 才能 为化 学模 拟 生 物 固氮提 供 全 面信 息 , 以指 导 化 学模 拟 物 的设 计 与 合 成 并提 出组 成 固 氮 酶 活 性 中心 原 子 簇 的 「 乳 和 〔 凡 」可 能分别是 还 原和 还 原位 点的设 想 此设 想如 经验证 , 将会 简化模 拟物 的化 学合成 , 可 望加速 实现 在较 温 和 的条件下 ℃ , 将 还 原成 姚 关键词 固氮酶 铁钥辅 因子 催化机制 化 学模拟 生物 固氮在 自然界氮素循 环 中起 着 重 要 作用 , 据 估 计全 球 每年 所 固定 的 量 约 达 亿 吨 ’】 , 为生物生 长 繁殖提供 了大量 氮素 生物 固氮是 由 固氮微 生 物体 内的 固氮酶 在 常 温 常压 下将 还 原 成 眺 的川 , 而 化 学 合 成 姚 则 需 要 在 高 温 或 ℃ 和 高 压 或 , 下 进行 , 消耗 大量 能源 并污染 大气 因此 , 研究 固氮 酶催 化 机 制及 化 学模 拟 生物 固氮 , 不仅在生命科学 和 化学催化科学上理论 意义重 大 , 而且 对农业持续发展 和环境保护将会 产生 深远影 响 近年来 , 由于 全世 界面 临能源 、 粮 食 、 人 口 和环 境等 问题 的挑 战 , 生物 固氮的研 究在世界各 国都受到重 视 , 其进 展 十分迅 速 本 文 着 重综 述 固氮酶的催 化机 制及 其化学 模拟 研究 的新进 展 和存在 的问题 固氮酶的组成 、 结构与功能 固氮酶 的组成 固氮酶 是 由钥铁蛋 白和 铁 蛋 白组 成 的 复 合 体 这 两种 蛋 白单 独 存 在 时 都 不 呈现 固氮酶 活性 , 只有两者形成 复合体后才具有 还原氮的能力 固氮酶对 氧极 敏感 , 浓 度 大于 一 “的 。 就使其失 活 钥铁蛋 白也称 组 分 或二 氮酶 铁蛋 白也 称组 分 芜兮 一 一 收稿 , 一 一 收修改 稿 国家 自然科学基 金 批 准号 《 场 、 农业生 物 技术 国 家重 点 实验室 和 国家博 士后 科 学基 金 资助项 目 了】

482 自然科学进展 第10卷 或二氮酶还原酶( Dinitrogenase reductase).为了区分不同来源的固氮酶组分,常以固氮微生物 的属名和种名的第1个拉」字母代表不同来源的微生物,以1和2分别代表钼铁蛋白和铁蛋 白.例如At1是指 Azotobacter vinelandii的钼铁蛋白,C2是指 Clostridium pasteurianum的铁蛋白 1.2固氮酶的结构与功能 1.2.1二氮酶( Dinitrogenase)1960年, Carnahan等人4成功地建立了具有稳定固氮活性的 无细胞提取物的方法.不久, Mortenson等人5首先确定了固氮酶是双组分酶复合体,之后, Kennedy等人6通过 SDS-PAGE证明钼铁蛋白(因含钼和铁而得名)有两种亚基.现已确定它 是一个a2B2型的四聚体,分子量为220-230k(因不同来源而异).a亚基分子量约为55000 u,由njD基因编码;亚基分子量约为6000nK基因编码.不同来源固氮酶钼铁蛋 级结构的氨基酸序列有47%~66%同源性,相当保守.目前在固氮菌中已鉴定出3种固氮 酶体系:钼铁固氮酶、钒铁固氮酶和铁铁固氮酶,后两种并不常见,只有某些固氮微生物在缺 钼条件下才产生,而且固氮活性低,放H2活性高.在本文中,若非特别指出,所提固氮酶均指 钼铁固氮酶 钼铁蛋白中含有两种金属原子簇:M簇和P簇.M簇通常称为铁钼辅因子( FeMoco),是 固氮酶的活性中心,70年代末由Shah7经酸处理钼铁蛋白后,用有机溶剂提取出来,在适当的 条件下,能直接催化乙炔加氢成乙烯.每分子钼铁蛋白含2个 Femoco,每个二聚体中含有 一个. Femoco由1个M,7个Fe和6~8个酸不稳定S组成,后来又发现 FeMoco上还连有1 个高柠檬酸分子8. FeMoco是钼铁蛋白特征性电子顺磁共振(EP)的信号来源.P簇最初由 Kutz等人自钼铁蛋白中分离出来,由2个4FeS组成,负责传递电子;每个q二聚体含有 个P原子簇 199年以来,美国学者Kim和Res等人0-13用X光衍射技术,先后解析了A. vineland (0.29m分辨水平)和C. pasteurianum(0.30mm分辨水平)的钼铁蛋自及其 FeMoco和P簇的 三维结构,使人们对固氮酶的结构及其催化机制有了更深入的认识 钼铁蛋白的a亚基和B亚基呈现出相似的折叠,都由3个/型结构域和一些单独的a螺 旋组成.每个亚基有3个结构域,它们之间有一个裂缝, FeMoco位于a亚基裂缝的底部,距蛋 白表面约1.0m.钼铁蛋白的α22四聚体是由2个呷二聚体非对称组成,P簇位于二聚 体的交界处,距钼铁蛋白表面大约1.0mm,距 FeMoco大约15mm").在二聚体中a和亚基 围,形成了一个直径08-1.0m,长为35m的通道(0)为 以轴对称的方式结合,与二聚体相关联的四聚体的双折叠轴为3亚基中的6个a螺旋所包 FeMoco是由2个缺口的立方烷型簇合物MS3Fe和 FetE3通过3个非蛋白配体S桥联 而成111°,其高柠檬酸通过1个羟基氧和1个羧基氧与 FeMoco的Mo原子共价连接(图1) 高柠檬酸也可与Gn9侧链以氢键结合,其周围有大量水分子,这些水分子很可能是底物还原 所需H+的来源. Peters等人lo的研究表明,至少有一部分H·是在 FeMoco上被还原的,高柠 檬酸在放H反应中起中介作用,若高柠檬酸被柠檬酸取代,N2的还原活力会大大下降,放H2 反应对CO的抑制变得较为敏感.a亚基提供了所有的多肽环境,H2和Cy525分别与FeMo co的M端和Fe端共价结合,Hi9可通过其咪唑基团的NH与 FeMoco中央的一个桥S原子 以氢键结合1,而Hi9和Gn9之间,以及Chn9与高柠檬酸末端羧基之间也都有可能形成 01994-2010ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net

自然科学 进 展 第 卷 或 二氮酶还 原酶 毗 为 了区 分 不 同来源 的 固氮酶 组 分 , 常 以 固 氮微 生 物 的属 名和种名 的第 个拉 ‘ 字母 代表不 同来 源 的微 生 物 , 以 和 分 别 代表 钥 铁 蛋 白和 铁 蛋 自 例如 是指 肠 的钥铁 蛋 白 , 伽 是指 ‘ 的铁 蛋 白 等 固氮酶的结构 与功能 二氮酶 肠 年 , 。 等人 陈 成功地 建立 了具有稳 定 固氮活性 的 无细胞提取物 的方法 不 久 , 。 等人 首 先 确 定 了 固氮酶 是 双 组 分 酶 复合 体 之 后 , 等人困 通 过 一 以 证 明钥铁蛋 白 因 含钥 和 铁 而 得 名 有 两 种 亚 基 现 已 确 定 它 是一 个 民 型 的 四 聚体 , 分子量 为 一 因不 同来 源而 异 。 亚 基 分子量 约 为 叉〕 , 由 和 基 因编码 归亚基分子量约为 拟 〕 , 由 扩 基 因编码 不 同来源 固氮酶钥铁蛋 白 一 级结构的氨基 酸序列有 一 同源性 , 相 当保 守 目前 在 固氮菌 中已 鉴 定 出 种 固氮 酶体系 钥铁 固氮酶 、 钒铁 固氮酶 和铁铁 固氮酶 , 后 两种 并不 常见 , 只有某些 固氮微 生 物在 缺 钥 条件下 才产生 , 而且 固氮活性低 , 放 活性 高 在 本 文 中 , 若 非特别指 出 , 所提 固氮酶均指 铂铁 固氮酶 钥铁蛋 白中含有两种 金 属原子簇 一 簇 和 一 簇 一 簇通 常称为铁 钥辅 因子 , 是 固氮酶 的活性 中心 , 年代末 由 〕经酸处理钥铁 蛋 白后 , 用 有 机溶剂提 取 出来 , 在 适 当的 条件下 , 能直接催 化 乙 炔加氢成 乙 烯 每分子 钥铁 蛋 白含 个 。 , 每个 邓 二 聚体 中含有 一 个 由 个 。 , 个 和 一 个 酸 不 稳定 组 成 , 后 来 又 发 现 上 还 连 有 个高柠檬 酸分子 凡 。 是 钥铁蛋 白特征性 电子顺 磁共振 的信号来 源 一 簇最初 由 等人刚 自钥铁蛋 白中分离 出来 , 由 个 映 组成 , 负责传递 电子 每个 邓 二 聚体 含有一 个 一 原子簇 年 以来 , 美 国学者 和 等人 〔‘ 一 ’ 〕用 光衍 射技术 , 先后解析 了 分辨水平 和 分辨水平 的钥铁蛋 白及 其 。 和 簇 的 三维结 构 , 使人们对 固氮酶 的结构及其催化 机制有 了更 深人 的认识 钥铁 蛋 白的 。 亚基 和 亚基呈 现 出相似的折叠 , 都 由 个 “ 日型结构域 和一些单独 的 。 螺 旋组 成 每个 亚基有 个结构域 , 它们之 间有 一 个 裂缝 , 。 位 于 亚基 裂缝 的底 部 , 距 蛋 白表 面 约 钥铁蛋 白的 民 四 聚体是 由 个 邓 二 聚体非 对称 组 成 一 簇 位 于 邓 二 聚 体的交界处 , 距 钥铁蛋 白表面 大约 , 距 凡 。 大约 ” 〕 在二聚体 中 。 和 归亚 基 以 轴对称 的方式结 合 , 与 邓 二聚体相关联 的 四 聚体 的双折叠 轴 为 日亚 基 中的 个 。 螺 旋所 包 围 , 形 成 了一 个直径 一 , 长 为 的通道 〔’剑 。 是 由 个 缺 口 的立方烷 型簇 合物 凡 和 凡 通 过 个 非蛋 白配 体 桥联 而 成 〔” , ’ , ’ 〕 , 其高柠檬酸通过 个 经基 氧 和 个 梭基氧 与 凡 。 的 。 原子 共价连接 图 高柠檬酸也可 与 侧链 以 氢键结合 , 其周 围有 大量水 分子 , 这些水分子很 可 能是 底 物 还 原 所需 的来源 等人 〔’ 】的研究 表 明 , 至 少有 一 部分 十 是 在 。 上 被还 原 的 , 高柠 檬酸在放 姚 反应 中起 中介 作用 若高柠檬酸被柠檬酸取代 , 叽 的还原 活力会 大大下 降 , 放 姚 反 应 对 的抑 制变得较 为敏感 。 亚基提供 了所有 的多肤环境 , 诩“和 分 别 与 。 的 。 端 和 端共 价结 合 , 可 通 过其 咪哩 基 团的 与 。 中央 的一个 桥 原 子 以 氢键结合 ’ 〕 , 而 和 之 间 , 以 及 ”,与高柠檬 酸末 端 梭基之 间也都有 可 能形 成

第6期友绍等:固氮酯催化机制及化学模拟生物固氮研究进展 pO.His Argosy GIn-19IOOCCH 最⑤Arg H, CH, COO 9OGIn"ly C)s-275 图! FeMoco的三维结构及其周围多肽环境 氢键 利用定位诱变技术对 Femoco周围氨基酸进行替换,既可以了解各氨基酸与 FeMoco的相 互关系,又可为研究催化机制提供信息.目前已基本明确与 FeMoco共价连接的Cys25和 His42都是高度保守的氨基酸,它们将 FeMoco固着在多肽链上,如被置换则突变株内游离 FeMoco的丰度大为增加,并完全丧失其活性;当Hs被置换时,也丧失固氮活性,但仍有低水 平还原放H2活性8.9;用Iys替换C9得到的lys突变型也有类似的情况),N2还原所 需H和电子无法传递,而H还原仍低水平进行,说明N2还原和H还原不在同一个位点 Km和 Newton等人2121利用Asm和Ch等替换Hs所得到的多种突变钼铁蛋白,分别研究 它们的催化活性,发现Gh突变钼铁蛋白能络合N2但不能还原N2,放H2反应受N2的强烈 抑制,说明放H2反应只发生在M簇上,而不是在P簇上,这就排除了Kim12)最初认为有一个 放H2位点是在P簇的二硫键上的可能性. FeMoco的结构及其周围多肽环境的变化对固氮酶 活性的影响是目前研究固氮酶催化机制的最活跃领域之 FeMoco结构的特别之处,是两个原子簇之间的6个Fe所呈现三角形几何学配位,这些不 饱和的铁原子可能与底物的结合有关,由于一个N2还原成氨至少需8个H和8个电子,所 以在 FeMoce附近必有一些潜在的质子和电子通道 现已确定P簇是由8Fe7S组成,1个4He4S和1个4Fe3S共用4Fe4S的1个S原子(还原 态)或1个4F4S和1个4Fe3(氧化态)通过2个半胱氨酸残基(Cy8和Cy)的S与邻近Fe 桥联而成2(图2),其余4个Fe分别与Cy2,Cys,Cy和Cys3s的巯基单独相连,将其固 定在a和β亚单位的交界处,目前普遍认为P簇在铁蛋白的4Fe4s簇和钼铁蛋白的 FeMoco之 间传递电子,但这仅是根据光谱学和动力学研究的推测,还缺少生物化学和遗传学的研究证 1.2,2二氮酶还原酶( Dinitrogenase reductase)二氮酶还原酶是由两个相同亚基组成的Y2 型二聚体,分子量约60ku(因菌种不同略有差异),每个亚基的分子量约30ku,由njH基因编

第 期 上 友绍 等 固 氮酶催 化机制 及化学模 拟 生 物 固氮研 究进 展 以 舫夕 ℃ 一 日 〔 、 单片比 、、尸﹃ 〔 一以 仁 图 、。 的三 维结构及 其周 围 多肤环境 ’ 氢键 利用 定位诱 变技 术对 周 围氨基 酸进 行 替 换 , 既 可 以 了解各 氨 基 酸 与 的相 互关 系 , 又 可 为 研 究 催 化 机 制 提 供 信 息 目前 已 基 本 明 确 与 。 共 价 连 接 的 和 刚 都 是 高 度 保 守 的 氨 基 酸 , 它 们 将 固 着 在 多 肤 链 上 , 如 被 置 换 则 突 变 株 内 游 离 。 的丰度大 为增加 , 并完全 丧失 其活性 当 被 置换 时 , 也丧失 固氮活性 , 但仍有低水 平还原 放 姚 活 性 〔’ , ’” 用 坊 替换 ”,得 到 的 场 突变 型 也有类似 的情 况 〔洲 , 从 还 原 所 需 和 电子 无法传递 , 而 还 原仍 低 水 平 进 行 , 说 明 还 原 和 十 还 原 不 在 同一 个 位点 和 等人 ’ , 刘 利用 和 等替换 所 得 到 的多 种 突 变 钥 铁 蛋 白 , 分 别研 究 它们 的催化活性 , 发 现 突变 铝铁蛋 白能络合 姚 但不 能还 原 , 放 反 应受 姚 的强烈 抑制 , 说 明放 场 反 应 只发生在 一 簇上 , 而不是 在 一 簇 上 , 这 就排 除 了 耐 ’ 」最 初认 为有 一 个 放 姚 位点 是在 一 簇 的二硫键 上 的 可 能性 。 的结 构及其周 围多 肤 环境 的变化 对 固氮 酶 活性 的影 响是 目前研究 固氮 酶催 化机制 的最 活跃领 域之 一 结 构 的特别之 处 , 是 两 个原子簇之 间 的 个 所 呈 现 三 角 形 几 何学 配位 , 这 些 不 饱 和 的铁 原 子可 能与底 物的结合有关 由于一 个 还 原 成 氨 至 少 需 个 和 个 电子 , 所 以 在 附近 必 有一些潜在 的质子 和 电子通 道 现 已 确 定 一 簇 是 由 组 成 , 个 麟 和 个 凡 共 用 的 个 原 子 还 原 态 或 个 和 个 氧化态 通 过 个半胧 氨酸残 基 和 娜 的 与邻近 桥联 而成 ” 」 图 , 其余 个 凡 分另 与 的 , · , , 田 和 日, , 的琉基单独相连 , 将其 固 定在 。 和 俘亚单 位 的交界处 目前普遍认 为 一 簇在铁 蛋 白的 回 簇 和 钥 铁蛋 白的 。 之 间传递 电子 , 但 这仅 是 根据 光 谱学 和 动 力 学 研 究 的推测 , 还 缺 少 生 物 化 学 和 遗 传 学 的研究 证 据 二 氮酶还 原 酶 公 二 氮酶还 原 酶 是 由两个 相 同亚 基 组 成 的 谈 型 二聚体 , 分子 量 约 因菌种 不 同略有 差 异 , 每个 亚基 的分 子 量 约 , 由 彝 基 因编

484 自然科学进展 第10卷 CysP ●●0y ●Cy 图2P簇的结构23 码.它只含Fe不含Mo,故又称铁蛋白,它的功能是提供二氮酶还原底物所需要的电子,Ceor grads等人21对A. vinelandii铁蛋白(A2)的晶体结构进行了分析:它是一个轴对称的二聚体 (图4上半部分),对称轴从正中穿过铁蛋白的4F4S簇,并沿着二聚体两个亚基之间的界面伸 展.每个亚基的结构均是一个大的αβ结构域(由8个平行β折叠片与9个a-螺旋构成,a螺 旋包围着β折叠片核心),两个亚基之间通过4F4S簇桥联.除了与4Fes4S的共价连接外,围绕 4Fe4s簇还有大量的疏水键和盐桥,以保证二聚体的稳定性,在铁蛋白内有两个 MgATP结合 水解位点7,一个在铁蛋白 Walker motif)段N末端的第9~16位氨基酸处,它与 MgAtP的 β,y-磷酸基团和Mg2结合;另一个 Walker motif在第125~128位氨基酸之间,它与moiA一起 完成整个蛋白与Mg核苷酸基团的相互作用, Mg-ATH结合-水解位点和4Fc4S簇靠近,两者直 接关系到电子由铁蛋白向钼铁蛋白的传递.每传递一个电子需要消耗2个ATP.除4Fe4S簇 和MgAP结合水解位点外,有的铁蛋白(如深红红螺菌和巴西固氮螺菌的铁蛋白上)还有 个ADPR( ADP-ribose)结合位点,在有铵的条件下,铁蛋白的Ag被ADPR共价修饰而失活; 无铵时脱去ADPR的修饰,又恢复其传递电子活性 铁蛋白的功能除作为固氮酶的组分之一参与固氮酶对底物的还原外,还有一些与催化无 关的功能25-:它参与 FeMoco的生物合成与组装;也参与钒铁固氮酶和铁铁固氮酶系统中 的anH和/H基因的表达调控 2固氮酶催化机制 Hageman,Buri, Thomeley和Lowe等人于70年代末至80年代中期,总结固氮酶催化N2 还原的过程是:2 MgATP与铁蛋白结合,铁蛋白2 MgATP与钼铁蛋白结合成复合物,ATP水解 复合物内发生电子转移(在生理条件下由铁氧还蛋白或黄素蛋白提供的电子,经铁蛋白的 4Fe4S转移到钼铁蛋白的8Fe7S,继而进人 FeMoco),底物结合与还原,铁蛋白2 MgADP复合物 与钼铁蛋白分离,2 MgATP替换出2 MgADP又形成铁蛋白-2 MgAtP复合物,如此完成一次循环 01994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net

自然科 ‘节进展 第 卷 ‘ 瑞 坦 ‘ 瑞 、’ 卜 ‘, , 矛“ 吕 阳 ‘ 飞 簇 的结构 纠 ‘ 盼附浦图外 , 之 码 它 只 含 凡 不 含 , 故 又称 铁蛋 白 , 它 的功 能是提供二 氮酶还 原底 物所需 要 的 电子 。 等人 〔 〕对 铁蛋 白 的晶体结 构进 行 了分 析 它 是一个 轴 对称 的二 聚体 图 上半部 分 , 对称轴从正 中穿过铁 蛋 白的 醉 簇 , 并沿 着 二 聚体 两个 亚 基 之 间 的界 面伸 展 每个 亚基 的结构均 是一 个大 的 盯归结 构域 由 个 平 行 俘折 叠 片 与 个 一 螺 旋构 成 , 一 螺 旋包 围着 日折叠 片核心 , 两个亚 基之 间通 过 簇桥联 除了与 麟 的共价连接外 , 围绕 科 簇 还有 大量 的疏水键和 盐桥 , 以 保证二 聚体的稳 定性 在铁蛋 白内有两个 〕 结合 水解位点 ’ 〕 , 一个 在铁蛋 白 肤段 一 末 端 的第 一 位 氨 基 酸处 , 它 与 幼 的 俘 , 一 磷酸 基 团和 扩 ‘ 结合 另一个 在第 一 位氨 基酸之 间 , 它 与 一起 完成 整个 蛋 白与 一 核昔 酸基 团 的相互 作用 〕结合 一 水解位点 和 簇靠 近 , 两 者直 接关系到 电子 由铁蛋 白向钥铁 蛋 白的传递 每传递 一 个 电子 需要 消耗 个 除 , 麟 簇 和 〕 结合 一 水解 位点外 , 有的铁 蛋 白 如深 红 红 螺 菌 和 巴 西 固 氮螺 菌 的铁 蛋 白上 还 有 一 个 一 一 结 合 位点 , 在有 按 的条件下 , 铁蛋 白的 心 被 共 价修 饰 而 失 活 无钱 时脱去 一 的修饰 , 又恢 复其传递 电子 活性 铁蛋 白的功能除作为 固氮酶 的组分之一 参与 固氮 酶对 底 物 的还 原外 , 还 有 一些 与催 化无 关 的功 能 比 一 洲 它 参与 。 的生物合成 与组装 也 参 与钒 一 铁 固氮酶 和铁 一 铁 固氮酶 系统 中 的 刃资和 了岁刀 基 因 的表达调控 固氮酶催化机制 , , 和 助 等人 于 年 代 末 至 年 代 中期 , 总结 固氮 酶 催 化 姚 还原 的过程 是 醉 与铁蛋 白结 合 , 铁 蛋 白 一 与钥 铁 蛋 白结 合成 复合 物 , 叨 〕 水 解 , 复合物 内发生 电子 转 移 在 生 理 条 件 下 由铁 氧 还 蛋 白或 黄 素蛋 白提 供 的 电 子 , 经 铁 蛋 白 的 料 转 移到钥铁蛋 白的 , 继 而 进 入 。 , 底 物 结 合 与还 原 , 铁 蛋 白 一 必 复 合 物 与铝铁 蛋 白分离 , 〕 替换 出 妞 又形 成铁 蛋 白 一 幼 复合物 , 如此 完 成 一 次循 环

第6期 王友绍等:固氮酶催化机制及化学模拟生物固氮研究进展 485 每循环一次传递1个电子,并消耗2个ATP.因此,每还原1分子氮生成2分子氨需循环8次 (见图3).一般公认的固氮反应化学计量式为 )+16MgATP-+ 2NH,+H2+16MgADP +16Pi 在上述过程中7,游离的铁蛋白和与钼铁蛋白结合的铁蛋白都可与 MgATP结合,但只有铁蛋 蛋白复合物才具有水解ATP的活性,ATP水解发生在电子传递之前,在铁蛋白-钼铁蛋 白解离之前只发生一个电子传递,ATP水解和电子传递是分别进行的.ATP的作用一方面提 供电子传递所需能量,另一方面引起铁蛋白构型改变 MoFe-蛋白R 化址k ADP 代谢过程 e-白ADPO MoFe蛋H 图3固氮酶催化反应示意图 Kim和Res0,根据A. vinelandii铁蛋白和钼铁蛋白的三维结构,进一步提出了两者相 互聚合和解离的模式,即镶嵌模式( Docking model,见图4).在这一模式中,铁蛋白二聚体与钼 铁蛋白的功能单位二聚体结合,由靠近铁蛋白4Fe4S簇一侧的Arg∞和Gu12残基连接在钼 铁蛋白哗二聚体上.铁蛋白二聚体的对称轴与aβ二聚体的对称轴基本重合,在P簇上方的 冠状结构内有一条沟,当两个蛋白靠近时,这条沟可以容纳从铁蛋白伸展出来且围绕4Fe4簇 的一些α-螺旋,在进行这一“螺旋嵌入沟槽”的定向过程中,使铁蛋白的4Fe4S簇与钼铁蛋白 的P簇靠近,同时也引起钼铁蛋白构型变化,使P簇更靠近 Femoco的高柠檬酸的羧基,距离缩 短到1.4m.如此沟通了电子传递通道.在此结合区域中,钼铁蛋白表面上具有带电和极性 一 MgATP结合-水解位点 M-85 图4铁蛋白-钼铁蛋白的镶嵌模式 o1994-2010chinaAcademicJournalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki,net

第 期 王 友 绍 等 固 氮 酶 催 化 机 制 及 化 学 模 拟 生 物 固氮研 究进 展 每循 环 一 次 传递 个 电 子 , 并 消耗 个 因 此 , 每 还 原 分 子 氮 生 成 分 子 氨 需 循 环 次 见 图 一 般 公认 的 固 氮 反 应 化 学 计 量 式 为 一 在 上 述 过 程 中〔’ 〕 , 游 离 的铁 蛋 白和 与 钥 铁 蛋 白结 合 的铁 蛋 白都 可 与 结 合 , 但 只 有 铁 蛋 白作目铁蛋 白复 合 物 才 具 有 水解 的 活 性 , 水解 发 生 在 电子 传 递 之 前 , 在 铁 蛋 白 一 钥 铁 蛋 白解 离 之 前 只 发 生 一 个 电子 传 递 , 水解 和 电 子 传 递 是 分别 进 行 的 的 作 用 一 方 面 提 供 电子 传递 所 需 能 量 , 另 一 方 面 引起 铁蛋 白构 型 改 变 权化 还 凉 代谢 过程 阮 一 蛋 白 一 ’ “ 一 蛋自 一 蛋 白 一 一 蛋 自 · 。飞 一 蛋 白 一 蛋 白 “ 引 图 固 氮 酶 催 化 反 应 示 意 图 ’ 和 〔’” , ” 〕根 据 铁 蛋 白和 钥 铁 蛋 白 的 三 维 结 构 , 进 一 步 提 出 了 两 者 相 互 聚 合和 解 离 的模 式 , 即 镶 嵌模 式 , 见 图 在 这 一 模式 中 , 铁 蛋 白二 聚 体 与 钥 铁蛋 白的功 能 单位 邓 二 聚 体 结合 , 由靠 近 铁 蛋 白 簇 一 侧 的 心 和 ‘’ 残 基 连 接 在 钥 铁 蛋 白 邓 二 聚 体 上 铁 蛋 白二 聚体 的对 称 轴 与 邓 二 聚体 的对 称 轴基 本 重 合 在 一 簇 上 方 的 冠 状 结 构 内有 一 条 沟 , 当两 个 蛋 白靠 近 时 , 这 条 沟 可 以 容纳 从 铁 蛋 白伸 展 出来 且 围 绕 簇 的 一 些 一 螺 旋 在 进 行 这 一 “ 螺 旋嵌 人 沟 槽 ” 的定 向过 程 中 , 使 铁 蛋 白 的 簇 与 钥 铁 蛋 白 的 一 簇 靠 近 , 同时也 引起 钥 铁 蛋 白构 型 变 化 , 使 一 簇更 靠 近 的 高柠 檬 酸 的梭基 , 距 离缩 短 到 如 此 沟通 了电子 传递 通 道 在 此 结 合 区 域 中 , 钥 铁 蛋 白表 面 上 具 有 带 电 和 极 性 结合 一 水解位点 簇 一 簇 一 簇 图 铁 蛋 白 一 钥 铁 蛋 白的 镶 嵌 模 式 〔‘。 · ” 」

自然科学进展 第10卷 的残基,和铁蛋白之间形成盐桥和氢键是至关重要的.蛋白之间可能有大量的离子键相互作 用,并存在一些潜在的重要的疏水作用.与铁蛋白Phe5有关的一系列氨基酸间的联系,可 能是从钼铁蛋白传递信号至铁蛋白上,使其发生ATP水解的通道60-3.动力学研究表明 伴随ATP的水解所引起的铁蛋白构型的变化,有利于电子自铁蛋白向铝铁蛋白的转移,M ATP水解成 Mg-ADP和P不会造成铁蛋白-钼铁蛋白复合体的解离 P簇和 FeMoco之间4个定向且平行排列的螺旋(a63-a74,a88092,a191-0209和p93-B106) 在电子传递中起主要作用,其中和P簇Cys和Cys相连的63-a74和a8892可能是潜在的 电子传递通道.固氮酶还原所需的质子来源于 FeMoco周围蛋白表面的HO*,高柠檬酸附近 的水化网参与了质子的传递,其中Cmn4-高柠檬酸 Femoco和Hs9- Femoco可能是通向FeMo- co潜在的质子通道 3化学模拟生物固氮——一历史和现状 近几十年来,化学模拟生物固氮的研究一直是国际上生物化学和化学工作者研究的一个 热点.特别是自美国学者Ree等人0.)阐明了固氮酶的活性中心原子簇及其周围多肽分子 的三维结构后,化学模拟生物固氮的研究再次掀起高潮 早期化学模拟生物固氮的研究,由于人们对固氮酶催化作用机制还不完全清楚,加之 FeMoco的组成及结构不明,要提出一个固氮酶活性中心原子簇的化学模型是相当困难的.在 FeMoco的三维结构未明确之前,国内外科学家提出了许多固氮酶活性中心原子簇的化学模 型,这些模型可归纳为三派:(1)钼派:认为氮络合在钼上.(2)铁派:认为氮络合在铁上 (3)钼、铁派:认为钼、铁对氮均有络合作用.早在70年代,卢嘉锡和蔡启瑞等人(x3就参与 FeMo∞o的结构研究,分别先后提出了福州模型和厦门模型,即“单网兜和双网兜状混合簇孪重 烷体的福州模型Ⅰ,Ⅱ”和“活口类立方烷和共角([Mo])胼联活口双立方烷的厦门模型I, Ⅱ”,引起国际重视. Schrauzer1%也于70年代提出了N2,C2H2和H在固氮酶中的络合与还原 模型,Mo原子是固氮酶的催化活性中心,№2还原过程中的放H2是由于中间产物N2H2的分解 所致;CO只抑制N2的还原而不抑制放H2, Stiefel(371曾指出活性中心的Fe原子是N2的络合 和还原位点,而由Mo原子提供用于还原N2的H+和电子.由于当时对 FeMoco的组成及结构 尚不明确,因而所提出的许多N2络合在固氮酶活性中心的化学模型在结构上也不一致.尽管 目前 Femoco的组成及结构已明确,但关于N2究竞是络合在 FeMoco的Mo上,Fe上,还是Mo和 Fe上,仍是众说纷纭38),而且大多未考虑 Femoco的另一主要功能,H+的还原发生在何处? Kim等人于1993年提出N2是络合在 FeMoco e6个铁原子上(图5(a),这样的络合方 式将使N=N键被削弱,更有利于N2的还原.Ome- Johnson劉认为在Kim模型中与高柠檬酸 同侧一S桥间的两个铁原子都可容纳N2使其还原(图5(d),Mo在N2的还原过程中不起直 接作用,卢嘉锡(福州模型Ⅲ)和 Staves等人{认为N2在与 FeMoco结合的过程中 MSFe3是N2的催化活性中心(图5(b));蔡启瑞42431(厦门模型Ⅲ)认为N2在固氮酶中的键 合位很可能是FeMo笼内位6Fep(n2,e4)模式和3Fe+1Mo位(3,∈4)模式,而不是笼 的2Fe模式(如图5(c)).近几年来,国内外理论化学工作者4-4依据Rees的 FeMoco中心 络合模型4,提出了他们各自不同的有关N2的键合模型,但基本未超出Homm所提N2 01994-2010ChinaAcademicjOurnalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

自然科学进展 第 卷 的残基 , 和铁蛋 白之 间形成盐桥 和氢键 是至关 重要 的 蛋 白之 间可 能有 大量 的离 子 键 相 互 作 用 , 并存在 一 些潜 在 的重要 的疏水作用 与钥铁蛋 白 尹 有关 的 一 系列氨 基 酸 间 的联 系 , , 能 是从钥铁 蛋 白传递信号 至铁蛋 白上 , 使 其发生 水 解 的通道 ’“ , 一 ” 〕 动力 学 研 究 表 明 , 伴随 即 的水解 所 引起 的铁 蛋 白构 型 的 变化 , 有 利 于 电子 自铁 蛋 白向钥 铁 蛋 白的转 移 水解成 一 和 不会造成铁蛋 白 一 钥铁蛋 白复合体的解离 一 簇 和 之 间 个 定 向且平行排列 的螺旋 一 , 一 , 一 和 四 一 印 在 电 子传递 中起 主要作用 , 其 中和 簇 祝和 相 连 的 一 和 。 一 可能 是 潜 在 的 电 子传递通 道 固氮酶还原所需 的质子来 源 于 周 围蛋 白表 面 的 姚 , 高柠檬 酸 附近 的水化 网参 与了质子 的传递 , 其 中 溯 一 高柠檬酸 一 价 和 一 。 可能是通 向 潜在 的质子通道 】 化学模拟生物 固氮 — 历史和现状 近 几 一 十年来 , 化学 模拟生物 固氮 的研 究一 直是 国际上 生 物化 学 和 化 学 工作 者研 究 的 一 个 热点 特别是 自美 国学者 等人 〔’。 , ” 〕阐 明 了 固氮 酶 的活性 中心 原 子簇 及 其周 围多肤 分 子 的 三 维结 构后 , 化学模 拟生 物 固氮的研究再 次掀起 高潮 早期化学模拟 生 物 固氮 的研 究 , 由于 人 们 对 固 氮酶 催 化 作 用 机 制 还 不 完 全 清 楚 , 加 之 的组成 及结构不 明 , 要提 出一个 固氮酶活性 中心 原 子簇 的化学模 型 是 相 当 困难 的 在 的三维结构 未 明确 之 前 , 国 内外 科 学 家提 出 了许 多 固氮酶 活 性 中心 原 子簇 的 化 学 模 型 , 这些模 型 可 归纳为三派 钥 派 认 为 氮络 合 在 钥 上 铁 派 认 为氮 络 合 在铁 上 钥 、 铁派 认 为钥 、 铁对氮均有络合作用 早 在 年代 , 卢嘉锡 和 蔡启瑞 等人 〔, 川 就参 与 的结构研究 , 分别先后 提 出 了福州模型 和厦 门模 型 , 即 “ 单网兜 和 双 网兜状 混 合簇 孪重 烷体 的福 州模型 , ” 和 “ 活 口 类 立 方 烷 和共 角 「 。 脐 联 活 口 双 立 方 烷 的厦 门模 型 , ” , 引起 国际重视 州 也 于 年代提 出 了 , 姚 和 在 固氮酶 中的络合与还 原 模 型 , 。 原子是 固氮酶 的催化 活性 中心 , 还 原 过程 中 的放 姚 是 由于 中间产物 姚 的分 解 所致 只抑制 的还原 而不 抑 制 放 姚 】曾指 出活性 中心 的 。 原 子 是 的络 合 和还 原位点 , 而 由 。 原子提供用 于还原 的 和 电子 由于 当时对 。 的组 成 及 结 构 尚不 明确 , 因而所提 出的许多 姚 络合在 固氮酶活性 中心 的化学模 型在结构上也不一致 尽 管 目前 。 的组 成及结构 已 明确 , 但关 于 从 究竟是络合在 。 的 上 , 一仁 , 还 是 。 和 。 上 , 仍是众说纷纭 〔’ 〕 , 而且 大 多未考虑 。 的另一主要 功能 , 十 的还原 发生 在何处 等人 「’ 〕于 年提 出 是 络合在 。 的 个铁原子上 图 , 这样 的络合方 式将使 二 键 被 削弱 , 更 有 利 于 姚 的还 原 一 〔’ 〕认 为在 模 型 中与高柠檬 酸 同狈一 桥 间 的两个 铁原子都可 容纳 使其 还原 图 , 。 在 蝇 的还 原 过 程 中不 起 直 接作用 卢 嘉 锡 ‘ 〕 福 州 模 型 和 , 等 人 】认 为 在 与 。 结 合 的 过 程 中 , 乌 是 的催 化 活性 中心 图 蔡启瑞 〔, 划 厦 门模 型 认 为 在 固氮 酶 中的键 合位很 可能是 笼 内位 内 犷 , 。 〕模 式 和 。 位 〔内 护 , 。 〕模 式 , 而 不 是笼 口 的 模式 如 图 近几 年来 , 国 内外理论 化学工作 者 「 一 州 依 据 的 。 中心 络合模 型 「’ 〕 , 提 出 了他 们各 自不 同 的有关 眺 的键 合模 型 , 但 基本 未超 出 仁刘 所提

第6期王友绍等:固氮酶僧化机制及化学模拟生物氮研究进展 48 Chan-Kim-Reesll4l d) Orme-JohnsonIl and Deng-I lotTmann!" ng-Hotfmann'可 图5N2与 FeMoco的结合方式..期,4,4则 在 FeMoco内的3种可能络合方式(图5(d)-(f).Ead和 Leigh51最初认为N2是和 FeMoco 中的多个铁原子络合的,而后 Leigh等人8又提出另一种可能的结合方式,N2通过取代高柠 檬酸的羧基而与M结合,高柠檬酸仍保留羟基氧与钼原子相连. Steven等人s认为在非缺 口的立方烷Mo的外侧将N=N还原,推测N2是络合在 FeMoco的Mo上.总之,现今所提出的 这些关于N2在 Fe Moco中络合和还原的模型(图5(a)~(f),仍为三派:即钼铁派40,42,、铁 派{…親-和钼派2,3,这些模型都缺少直接的试验验证,而且除蔡启瑞44提出的厦门 模型外,大多未涉及到放H2的方式.根据Lang等人在研究固氮酶前稳态期的H2爆发和 90年代初我们提出的固氮酶双位点放H2模式5),我们认为独立于N2络合和还原位点之外的 另一放氢位点,可能是发生在 FeMoco的Mo原子上,而 FeMoco的Fes3Fe3可能是N2络合还原 中心(图5(g)).目前,化学模拟生物固氮的研究仍主要处于理论化学研究阶段w,所有已提 出的固氮酶活性中心原子簇络合№2的化学模型正确与否有待通过实验进一步加以验证 总之,对 FeMoco的功能,除确定№2的络合还原部位外,还需要确定H·还原放H2的部位, 因为固氮酶在生理条件下催化N2还原生成NH3的同时,也催化H+还原放出H2,使固氮酶(包 括 FeMoco)处于H2气氛条件下,免遭O2的危害.因此,N2和H的确切络合位点及其还原的 01994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse,Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

第 期 王友绍 等 固氮酶催 化机制及 化学模拟生 物 固氮研究进 展 沪 币 卜 知二 卜 丫 , 命广 心匀 …,卜 咬 、 峨多 飞 欲夕 招 今 ︸ ︺ , 一 吐一 一 丰 厂及越 、 狱厂 长多 、 、 , 峪 、 、了 、 、、 , 、 、 , 、 、 , 才 、 — 十 — 诊么 谬 乙 舒 这 狱 川 、 勺, 月 丫 ‘ ︸ 一 一 一 ‘ 一 刊 一 一 一 ’川 、 一 卜 〔 声 勺﹄ 口 入议性 义夕 命广 、 图 姚 一 与 。 的结合方式旧 , ” , 、 , , , 刘 在 。 内的 种 可 能络合方式 图 一 和 挽 〕最 初 认 为 是 和 。 中的多个铁原 子络合 的 , 而 后 址 等 人 「 又 提 出另 一 种 可 能 的结 合 方 式 , 通 过 取 代高 柠 檬酸的梭 基 而 与 。 结 合 , 高柠檬 酸仍 保 留经 基 氧 与钥原 子 相 连 。 等人 到 认 为 在 非 缺 口 的立 方烷 。 的外侧将 一 还原 , 推测 是 络合在 。 的 。 上 总之 , 现 今所提 出的 这些关 于 在 。 中络合 和还 原 的模 型 图 一 、 , 仍 为三 派 即铝铁 派 「, , 叫 、 铁 派 〔’ , ’” , 一 刘 和铝派 , 〕 这 些模 型都缺少 直接 的试 验验证 , 而 且 除蔡 启瑞 , “ 〕提 出 的厦 门 模型外 , 大 多未 涉及 到放 姚 的方式 根 据 等人 刘 在 研究 固氮 酶前 稳 态 期 的 爆 发 和 年代初 我们提 出的 固氮酶 双位点 放 姚 模 式 「 , 我们认 为独立 于 络合和 还 原位 点之外 的 另一放 氢位点 , 可 能是 发 生在 。 的 。 原 子 上 , 而 。 的 凡 可 能是 络 合还 原 中心 图 目前 , 化学模拟 生物 固氮 的研 究仍 主要 处 于 理 论 化 学 研 究 阶段 占刘 , 所 有 已 提 出的 固氮酶活性 中心 原子簇络合 姚 的化学模 型 正确 与否 有待通 过实验进 一步加 以 验证 总之 , 对 。 的功能 , 除确定 的络合还原部位外 , 还需要确定 还原 放 玩 的部位 , 因为 固氮酶在生 理 条件下催化 还原生成 姚 的同时 , 也催化 还原放 出 姚 , 使 固氮酶 包 括 。 处 于 气氛 条件下 , 免遭 。 的危 害 因此 , 和 的确 切 络 合位 点及 其 还 原 的

自然科学进展 第10卷 质子和电子通道的阐明,就成为当今研究固氮酶活性中心催化机制及其化学模拟的关键问题 随着定位诱变蛋白质工程和波谱技术的发展,以上问题可望得到解决.但生物固氮的运行,除 以固氮酶作为催化剂外,还必须有质子、电子和ATP参与反应 固氮酶,常温,常压 N2+8H++8e-+16ATP 2NH3 +H2+ 16ADP+16pi 而化学合成氨是以Fe为催化剂,在高温(350℃或500℃)高压(50662或35464kPa)下,将N2 加H2还原成NH3 N2+3HbF触媒高温,高压 对比以上两反应式可以看出:化学模拟生物固氮除模拟合成固氮酶活性中心原子簇外, 还必须提供质子电子和ATP,才可能实现在常温常压下固氮,而提供大量的ATP用于化学合 成氨是不现实的,因此,通过化学模拟研究,实现在温和(<300℃,<5066kPa)条件下合成氨 的设想是比较符合实际的.由于 FeMoco极不稳定,至今尚未获得由化学合成的、完整的FeMo co,如果只合成与№2络合还原有关的原子簇就容易得多.其实早在100多年前,法国化学家 roussin就合成了第1个被称为 Roussin黑盐( Black roussin salt)的铁硫簇合物阴离子 [FeS3(NO)],而且又被卢嘉锡叫证明具有催化活性.因此,当前化学模拟生物固氮的研究 策略,最好是采用这种类似FeS结构的簇合物作为催化剂,适当提高反应的温度(300℃以下) 和压力(5066kPa以下),以利于H2的活化和削弱N2的三重键,以及正反应的进行;且不必改 变现用设备,即可达到节约能源、降低生产成本、增加经济效益的目的 致谢感谢蔡启瑞教授给予的指导和有益的讨论 参考文献 1 Newton W E. Nitrogenases: distribution, composition, structure and function. In: Palacios R, Newton W E, eds, Newton Horizons in Nitrogen Fixation. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 1993 2 Evans H J, Burris R H. Highlights in biological nitrogen fixation during the las 50 years. In: Stacey G, Burris R H, Evans H J, eds Biological Nitrogen Fixation. New York, London: Chapman Hall, Inc, 1992.1 3 Cumahan JE, Mortenson L E, Mower H F, et al. Nitrogen fixation in cell-free extracts of Clostridium pasteuranium. Biochim Biophys 4 Cumahan J E, Mortenson L E, Mower H F, el al. Nitrogen fixation in cell-free extracts of Clostridium pastetranium. Biochim Biophys Acta,1960,44:520 5 Mortenson L E. Nitrogen fixation in extracts of Clostridium pasteuranium. In: San Pietro A, ed. Nonheme Iron Proteins: Rule in Ener- gy Conversion. Yellow Spring, Ohio: Antioch Press, 1965. 243 6 Kennedy C K, Eady P R, Kondorpsi E, et al. The molybdenum-iron protein of Klebsiella pneumoniae nitrogenases. Biochem J, 1976 155:383 7 Sheh V K, Brill WJ, Isolation of an iron-molybdenum cofactor from nitrogenase. Proe Natl Acad S:i USA, 1977, 74: 3 249 8 Shah V K, Imperial J, Ugalde R A, et al. In nitro synthesis of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. Proc Natl Acad Sci USA 9 Kurtz D M, Jr MeMillan R S, Burgess B K, et al. Identification of iron-sulfur centers in the iron-molybdenum proteins of nitrogen: Proc Null Acad Sci USA, 1979. 80: 4 723 10 Kim J, Rees D C. Crystallographic structure and functional implications of the nitrogenase molybdenum-iron protein from Azotobacter o1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net

自然 科学 进展 第 卷 质子 和 电子通道 的阐明 , 就成 为 当今研究 固氮酶活性 中心催化机制及其化学 模拟 的关键 问题 随着定 位诱变蛋 白质工程 和波谱技术 的发 展 , 以 上 问题 可 望得 到解决 但生 物 固氮 的运 行 , 除 以 固氮酶作为催 化剂外 , 还 必须有质 子 、 电子 和 〕 参与反应 · 一 十 一 姗哩垦些鱼邑鱼笃 , 而化学合成氨是 以 为催化剂 , 在 高温 ℃或 ℃ 高压 或 麟 下 , 将 加 姚 还原成 姚 姚之型晒卫 鱼笃 对 比 以 上两反应 式可 以看 出 化学模拟 生 物 固氮 , 除模 拟合成 固氮 酶 活性 中心 原 子簇 外 , 还必须提供质子 、 电子 和 , 才可 能实现在 常温 常压 下 固氮 , 而 提 供 大量 的 〕 用 于 化 学 合 成 氨是不现实 的 因此 , 通过化学模拟研究 , 实现在温 和 ℃ , 条件 下 合成 氨 的设 想是 比较符合实 际 的 由于 极不稳 定 , 至 今 尚未获得 由化学合成 的 、 完整 的 。 。 , 如果 只合成 与 络合还原有关 的原 子 簇就 容 易 得 多 其实早 在 多年 前 , 法 国化 学 家 〔 就合成 了 第 个 被 称 为 枷 。 黑 盐 沮 的 铁 硫 簇 合 物 阴 离 子 「’习 」 一 , 而且 又被卢嘉锡队 〕证 明具有催 化 活性 因此 , 当前化 学模 拟 生 物 固氮 的研 究 策略 , 最好 是采用 这种类 似 凡 结构 的簇合物作为催化剂 , 适 当提 高反应 的温度 ℃以 下 和压 力 以 下 , 以 利 于 姚 的活化 和 削弱 的三 重键 , 以及 正 反 应 的进 行 且 不 必改 变现用设备 , 即可 达到节约能源 、 降低生产成本 、 增 加经 济效益 的 目的 致谢 感谢蔡启瑞教授给予的指导和有益 的讨论 参 考 文 献 罗 , 洲 〕 , 伽 , , 阳 , , 刀 而 , , 币 刹 们 玩 , 币 , , 吧 〕 卿 , 刀 蓝 , , 叨 , , , 一 以 帅 产刃 八 瓜 , , 日〕 , , , , ℃ 一 汉 产月“ , 印 , 笋友乙 进八乙瓜姗 , 川 留 、 咫 , 〕℃ , 司 , , 呷 , 瓜加 坛 尸 〕 , , 巧 , 阮 肋 、 , , , 呷 八吵 , ” 曰 司触 〕 〕 洲 , , , , 《 , 一 创 洲 八 〕 , , 为 , , 叮 娜 哪 刃 洲 一 击曲 〕械

第6期 王友绍等:固氮酶催化机制及化学模拟生物固氮研究进展 inedeulit. Nalur, 1992, 360: 553 I1 Kim ], Rees D C. Structural models for the netal centers in the nritrogeunbw: mmlyixIenum-iron protein, Scienee, 1992, 257: 1 677 2 Kim J, Wiw, D, Rees DC. X-lay cyst: l struture of the nitrogenase inolylxdenuttH-irn proein frm Clostridiun pwusleunwun at 0.3 resolution. Biuxhetn, 1993, 32: 7 104 13 Kim J, Rees D 4 Chan M K, Kim J, Rees D C. The nitrogenase FrMorenfar tur and P-chnster pair: 0.22 nun resolution sluctun*. Science, 1993, 260 15 Bolin JT, CurmpMlt so N, Muchmore T V, et al. The structure and environnent of the metal cluster in the nitrogenase Mok e prtein foun Costridium pasteurianum. In: Stiefel E 1. CaxIeouvanis D, Newlon W E, es. Molybdenum Enzymes, Cofactors a nd Mxlel Sys- term. WaShington, D C: Am Chein Soe, 1993. 186 16 Peter J W, Fisher K, Deun D R, Nitrogenase structure and funetion: A bioxhemical-genetie perspective. Annu Rey Micmbiol, 1995 I7 Howanl J B, Rees DC. Nitrogenase: a nueleotide-dependant molecular switch, Annu Rev Biehe, 1994, 63: 235 18 KeIm H M, Baines M, Gormal C, et al. Analysis of site-directed mutaions in the a- and B-subunits of Klebsiella pweum 19 Kent H M, loannidis I. Gomal C, e al. Site-direclex mutagenesis of the Klebsiella pneumoniae nitrogenase. Biochem J, 1989, 264 DJ, Dean D R, Newton W E. Nitrogensae catalyzed ethane pruduction and CO- sensitive hydrogen evolution from MoFe proteins having amino acids substitutions in an a-subunit FeMo-cofactor hinding domain, J Biul Chem, 1992, 267 20 002 21 Kin C H, Newton W E, Dean D R. Role of the Mof'e protein a-subunit histidine-195 residue in FeMo-cofactor binding and nitrogenase alalysis. Biochem, 1995, 34: 2 22 Newton W E, Fisher K, Shen C H, et al. Probing catalytic funetion through amino-acid suhstitutions in Azotobacter vinelandii molyixde- In-dependent nitrogenase. In: Tikhonovich I A, Proworov N A. Romanov V I. et al eds. Nitrogen Fixation: Fundaments and Appli 23 Peter J W, Stowell M H, Solis S M, et al. Redox-dependent structural changes in the nitrogenase P-cluster. Biochem. 1997, 36(6): I 18 4 Gewgialis MM, Komja H, Chakrabarti P,, et al. Crystallographic structure of the nitrogenase iron protein frun Azotobacter rineandit Sience,992,257:1653 25 Rhinsin A C, Burgess B K, Dean DR. Activity, reconstitution and accumulation of nitrogenase components in Azotobacter vinelandii mutant strains containing defined deletions within the nitrogenase structural gene cluster. J Bacteriol, 1986, 166: 6 Gavini N, Burgess B K. MoFe cofactor synthesis by a nif H mutant with altered MgATP reactivity. J Biol Chem, 1992, 267: 21 179 27 Paustian T D, Shah VK, Roberts G P. Apodinitrogenase: purification, association with a 20-kilodalton protein, and activation by the ironl-npolybdenum cofactor in the absence of dinitrogenase reductase. Biochem, 1990. 29: 3 515 28 Rbinsin A C, Chun T W, LiJ G, et al. Iron-molyblenuin cofactor insertion into the apoprotein of nitrogenase involves the iron proteit MgATP eoxnplex. J Biol Chem, 1989, 264: 10 08 29 Juxerger R D, Wolfinger E D, Bishop P E. The gene encoding dinitrogenase reductase 2 is required for expression of the second alterna- tive nitrogenase from Azotobacter vinelandii. J Bacteriol, 1991, 173: 4440 30 Thorneley R N GA, Fisher K, et al. Eleetron transfer reactions associated with nitrogenase from Klebsiella pneumonie. In: Stiefel E l, Coutnuvanis D, Newton W E, els. Molylxdenum Enzymes, Cofa tors, and Moxlel Systems. Washington, DC: Am Chem Sox,1993.290 I Deits 'T L, Howard J B. Effel of salts on Azotobacter vineland nitrogenase ar tivities. J Biol Chem, 1990, 265 3 859 32 Wolle D, KimC H, Dean D R, et al. lonie interaction in the dinitrogenase complex: properties of Fe-proleit ing substations fu Arg-100, J Bind Chet,1992,267:3667 33 Peter J W, Fisher K, Dean DR. Identificalion of a nitrogenase protein-prodein inleraction site defined by residues 59 though 67 within the Azotobacter vinelandii Fe protein. J Biol Che, 1994, 269: 28076 C1994-2010ChinaAcademicJOumalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net

第 期 工 友 绍等 固 氮酶催 化机制 及化 学模拟生 物 固 氮研究 进 展 门日闷 , 刃 址爪 以 一职 , , , , 川。里 耐 一 一 , 一 罗 脚 ”〔 一 一 ,一、一 致 毛 , , , 、一 , 、 一 叮 、 卿 , 川 职 。 ,罗 洲 、 , 、 一 、 ” 八以一 洲“‘ 群群‘ , ‘ 几 比阴 一 一兄 , , , , , , 《滋 ,罗 〔‘ 。 , , , 凡 , ‘ 仆 ,一姗 〔卜 、 ’ 一 、 盯 滋 , 川 伴 反 ‘ 一 , 卯 , 印 佳 ‘ , 汕 , ’ , ‘ 一 一 此 仪 纽 一 , 眯 ’ 、一 一 创哪 浏 俐 逮“ 月“ , 一 三 , 叫 , 翻 一 对 , 一众 比 歇一 麒 , , 、 , , 阴 脱 仪 而 一 邵 〔 价 让一 。 , , 礴 , 出、 , ‘ 罗 姗 一‘ , ‘ 一, , 一 , 苗 、 , ‘弘川 川 , 劫 一 , 司 〔 一 俘 一 、 月 玩扮左“ 尸 , , 爪 , , 、, 、 〔一 , , , , , 一 从 坛 尸 姗 器 , , 麟 , , , , 邓 耐 山 一 面罗 沁 价 , 删 一 一 一 , , , , , 一 一 凡 一 一 一功扩 韶 , , , , , 一 加 了 刀 硅 配‘ 。。么碱 , 过 一 脱 , 卫〕 , , 司 罗 二 场 , , 习 司 而 , , , , 一 即 阁 罗 一 , 如 , 肠吧 , , 叭 , 仃 尸 腼 击 。 队双 健。 沉 “纪口 阴 汽 】, 卯 , 】 】 出 器 , , 出 用 一 月之。 , 丫 沉刀更于“ 成 , , 峨〕 , 可 】〕 , 卯 , 〕 , , 一勺 洲妇 川 , 、 一 耐 卿 , 一 】例 罗 互戮 吠卜 , 拟 〕 , , , , 姗 一 团 山 侧 , , 出。 一 , , 记讲 拍卿 , 罗 , 叩 罗 记 嗯 , , 阎 〕化 一 舰 呢 朋 ” 卜七口 ￡占山 理〔 公 , , 伽 , 卿 , 场 , , 以 吐 。” 二 叩 灿记 诚 血 , 赶 、 月杰 尸 硬二朋。 , , , 州 ” , , , 出 己 耐 多 , 勺 阮 , 驯〕 、 『 , 脚耐 卜」竺 刘 七。 ￡汉砚“ 绝。 刀认 才人 邵 以 , 叭 , , , , 〔 罗 哪 哪 价 一 二 一 开 片 田 。、 姗 , 叨 , 伪 , , 一 司 , 七。 八翻 健 “月亡 “ 门硬五 拍 , , 一, 内

自然科学进展 第10卷 34 La jx. Researh on ie cluneal naxle-ling of biologial nilnugen fixat ion in Ibe new thinr-anl overview of wean+ earried oul at the Fujian Institute lring th 1970 i B il the Parly 1980. In: Hong G F, e. 'The Nitrogen Fial iu anl Its Resear h in China. Shanghai 35 Tsli K R, Wan H L. On the Nlnnlure-functioan nlationslip of nitmgellase M-lusler and P- luster pairs. Joumal of Cluwer Scien lixalion: pusl progress and reeent advances. In: Banerjea 1, eL. CaNniination Cheamistry-20, OxforD, New York, term Paris, Frakfum1: Perganw it Press, 1980.149 37 Sielel E l. Te necha iNn iN itrogen fixation. in: Newton W E, PsIgate J R, Roulriguez-BarmettC, es Rewent I)ve louuneals in 38 Richunis R L. Che'lltieal mxxlels for the funetion of nitre In:Elmerich C, konthoosi A, Newton W E, eb. Bioiogical Nitnagrtl (hTte-Johrsun W Il. Nitlgen se strueture: whor lo tmw? Scienee, 1992, 257: I 639 40吴新涛,卢启锡,固氮酶活性中心网兜模型研究的叫顾与展望.科学通报,1995,40(7):577 41 SaviN A K, Z mer M C. A theoretical mxl for the active sile of nitrog uase. Chem Eur J, 1996, 2(1):83 42方惠梾,苡静伟,蘩启瑞,等。化学探针方法研究固氮酶M簇和簇对的结构与功能关系,厦门大学学报(自然科学 43黄静伟,张风,许良树,等.固氮酶及合成氨催化剂中N2的络合位,高等学校化学学报,1995,16(6):920 44 Plav W. Eletronic structure of the iron-mlylxletum and altemative cofactors of nitrogenases: a comparison and its tone uenees, j Mel struct,994,315:53 5 Dince I G. The billing and reduction of dintrogen al an Fe, face of the FeMo cluster of nitrogenase, Aust J Chem, 1994, 47: 979 46 Danc: I G. Cale ulated delails of a methanism for conversion uf N2 to NH, at the FeMo cluster of nitrogenase. J Chem S", Chem Com- tu,197:165 47 Darme I G. Unlenslanding structur and reactivity uf new fundamental inorganic molecules: metal sulfides, metallo aix hralrenes, anf 48 Machado F B C, Davidson E R. N2 activation by iron-sulfur conplex. Theor Chim Acta, 1995, 92(5): 315 49 Zhang SJ, Liu Cw. Possible birling niles for dinitrogen activation by the Fe Mo-cofactor in nitrogenase. Palyhrlron, 1997, 16: 6 50 Deng ll, Hoffmann R. How N, might be activated by the Fe Mo-cofator in nitrogrrunse, Angew Chen Int Ed Engl, 1993, 32(7):1062 51 F uly RR, leigh G 3. Metals in the nitrogenases. J Chem Soc, Dalton Trans, 1994: 2 739 52 Leight G J. The chenical mehanism of biological nitrogen fixation and the chemistry of model systems. In: Tikhonowich I A ow V I, el al els. Nitrogen Fixation: Funan e nts and Applications. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Acade irx,1995 53 Steven MM, Arlon M S, Patrich E M, el al. Catalytic reduction of cis-dithyldiauzene by the [MoFe S4]+cluster. The four-elrmlromn rHluetinl N a N=N rotd by a nitrogenase-relevant cluster and implications for the function of nitrogens. J Am Chetn Soc, 1997 54 Liang J H, Burmis R H. Hydrogen burst associated with nitrogenas-eatalyzed reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 9 446 55张振水,吴柏和,李季伦,固氮酶催化的放H反应,做生物学报,1993,33(5):320 56广始锡,陈忐达。过渡金属原子簇的类芳香性,物理化学学报,1992,8(6):834 01994-2010ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishingHousealLrightsreservedhttp://www.cnki.net

自然科 学进 展 第 卷 一 丈。 、 、 ‘ 出、 、 一《 一 一〔 任一 ‘。 ‘ , , 、 。通 正 , , , 一习 一 一、罗 一 , 一 一 卜 、。、 一 小 伴、 洲 一 找 硬 一 。 卜 。 、 , 、、 一 , 卜, 、 、 。、 一、 出勺 、 〔 吕 十 , , 。 ‘ 。 ,罗。 卜 ’ 一 万 , , 、 、 出、 , 一之“ 一拜一之王 尸 一 , 出 ’ 仆 , 【 、 〕一一 一, 呀 , ’ 味 , 遨 、 , , 一。。 。、 一 、 “ 夏 、 一 一 甲 一公 一 , 出 , 一‘ 一 一书 , ”目 〔, 二 、 , , ‘ , 明 , ,卜是一 一 ‘、一 二 , 一片 一 一 圣一丈卿 ℃ 洲 川 巴 以 尧 , 以 , 朋 城 仃 一 ,刘 一“ , 丫‘, 长 , 、 一硬 , , 址 , 沮水 ” 乍一琶 们 〕 ℃ , 认 ‘ 玲 盯一 阴‘ , ,一 一 , 】 , 粉, 吕 一 , 一刘 一 明 , , “ 、 一 ‘ 一 一 拜 · 于 ’ 一一 卫 ‘ , 一》 , 欲 朋 一 〔,出 五二 , , 一,卜 八 又 、 五〔沮 一减 三 一 忍 一附 祀 〔, , 为 , , ‘ 替 ,目 罗万 卜 ’ 之孟一‘, 一 ‘ 一 一‘毛 恶 州 汕 ℃ 飞 , , 一 一 州 正· ‘二以 仙 , 一 由 , 卯 , 、、‘卜 , 一、。, 梦 洲 一 。一 “ 一。 , 、 一 淤 , , 吴新 涛 , ’ 嘉锡 固氮酶 活性 中心 网 兜模 型 研究 的 回顾 与展 望 科学 通 报 , , 。、 , 。」, , , 。刘 片 ‘ 、 , , 〕 留 ,。 , , 少 惑 霖 , 黄静伟 , 蔡启瑞 , 等 化学探 针 方法 研 究 固 氮酶 一 簇 和 , 簇 对 的 结 构 与功 能 关 系 厦 门大学 学 报 自然科 ‘、产 版 , , 黄扑千, , 张风 章 , 许 良树 , 等 固 氮酶及 合成 氨催 化 中 的 络合位 高等 ‘ 攀校 化学学 报 , , 断、 。 、 川 此 。 一 , 。 滋 ,知 。。公“ 廿 脱 。肛甲 溯 、 绷一 。、 , 一 , , 。。 , 吧 罗 彻 、 哪 怒 门 , , 。 。。 、 二己, 一记 山 , , 〔 ,、 姚 ’ 。 阮 , 一, 拟 〔诬 朗 一 以 ”召走旧 朋 毗 至 , 沮 ,胡 五 一以 祀一 , 即 一 罗 是醋 卜 , , 。工。 ’ , , 一 ,耳, , , 乙一朋 , 盛 二 ’ 、 , 一 ’ 似 、 ,罗 〕 一 “ 《 飞 、 以 , , , 于 出 · 五砂 , 司 ’ 一 , , 伪 , , , 一己 、唱 幽 洲 , 〔〕 , 、 、 罗 、 叮 司 一 垃 , 。 , 。 , , 〔, , ‘, 勺 ’ , 《 , 月 凡 出 司 勺 ,讨 记 , , , 扣击〕 幻 二 七企卜 妊夏 ‘ 科 , 。。 、 , 颇 。 , , 一 , 。 。沮 。 喇 , 、 一 , 。,山 。 ‘,残 」 十 。 仆 。 一 一。 , , , 《江 刊 场 劝 , 一 , 〕 , , , , 坛唱 化 出 一 罗 一 蒯 此 洲 耐 , , 张振 水 , 吴 柏 和 , 李季 伦 固氮酶催化 的放 反 应 微生 物学 报 , , 卢 嘉锡 , 陈志 达 过 渡金 属 原 子簇的类芳 香性 物理 化学学报 , , 气口气、一 工︸