生物工程学报 李欢欢等基于 CRISPR-Cask的功能基因筛选研究进展461 Chinese Journal of Biotechnology http:/ljournals.im.ac.cn/cjbcn Apr.25,2018,34(4):461-472 Do:10.13345/cjb.170348 @2018 Chin J Biotech, All rights reserved 综述 基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展 李欢欢,黄承浩 厦门大学生命科学学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,福 建厦门361102 李欢欢,黄承浩.基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展.生物工程学报,2018,34(4):461-472 Li HH, Huang CH Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Chin J Biotech, 2018, 34(4): 461-472 摘要:功能性基因的筛选是探索生物进程、研究疾病发生发展和诠释基因功能的重要方法,在生物、医药、新 治疗靶点筛选及肿瘤耐药等方面有广泛的应用。 CRISPR-Cas9( Clustered regularly interspaced short palindromic peat sequences/CRISPR- associated protein9)技术作为近期热门的基因编辑工具,能够高通量地对基因组进行精 准修饰,为实现功能性基因的筛选提供了简便髙效的技术攴持。文中对 CRISPR-εas9技术应用于功能性基因筛选 的方法及研究进展进行了综述, 关键词: CRISPR-Cas9,基因敲除文库,功能性基因筛选 Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Huanhuan Li, and Chenghao Huang National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China Abstract: Functional genetic screening as an important method for exploring biological processes, diseases development research and functional annotation of genetic elements, has been widely used in pharmaceutical research, new therapeutic targets identifying and screening, and tumor resistance. CRISPR-Cas 9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9) is the newest tool in the geneticists toolbox, allowing researchers to edit genome with unprecedented ease, accuracy and high-throughput. CRISPR-Cas9 system provides a high-throughput, practical and efficient tool for the discovery of functionally important genes responsible for certain phenotypes. In this review, we ummarize the characterization of CRISPR/Cas system and applications of this new genetic toolkit in functional genetic Keywords: CRISPR/Cas9, genome-scale knockout library, functional genetic sc Received: September 6, 2017; Accepted: October 30, 2017 Supported by: National Natural Science Foundation of China(No. 8157199 Corresponding author: Chenghao Huang. E-mail: huangchenghao @xmuedr 国家自然科学基金(No.81571990)资助。 网络出版时间:2017-11-07 网络出版地址:htp:/ kns cnki. net/kcms/ detail/1.19980.20171107.1703.003html
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http://journals.im.ac.cn/cjbcn Apr. 25, 2018, 34(4): 461−472 DOI: 10.13345/j.cjb.170348 ©2018 Chin J Biotech, All rights reserved Received: September 6, 2017; Accepted: October 30, 2017 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81571990). Corresponding author: Chenghao Huang. E-mail: huangchenghao@xmu.edu.cn 国家自然科学基金 (No. 81571990) 资助。 网络出版时间：2017-11-07 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20171107.1703.003.html 生物工程学报 461 基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 李欢欢，黄承浩 厦门大学生命科学学院 分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福 建 厦门 361102 李欢欢, 黄承浩. 基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展. 生物工程学报, 2018, 34(4): 461–472. Li HH, Huang CH. Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system. Chin J Biotech, 2018, 34(4): 461–472. 摘 要: 功能性基因的筛选是探索生物进程、研究疾病发生发展和诠释基因功能的重要方法，在生物、医药、新 治疗靶点筛选及肿瘤耐药等方面有广泛的应用。CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9) 技术作为近期热门的基因编辑工具，能够高通量地对基因组进行精 准修饰，为实现功能性基因的筛选提供了简便高效的技术支持。文中对 CRISPR-cas9 技术应用于功能性基因筛选 的方法及研究进展进行了综述。 关键词: CRISPR-Cas9，基因敲除文库，功能性基因筛选 Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Huanhuan Li, and Chenghao Huang National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Dciseases, State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China Abstract: Functional genetic screening as an important method for exploring biological processes, diseases development research and functional annotation of genetic elements, has been widely used in pharmaceutical research, new therapeutic targets identifying and screening, and tumor resistance. CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9) is the newest tool in the geneticist’s toolbox, allowing researchers to edit genome with unprecedented ease, accuracy and high-throughput. CRISPR-Cas9 system provides a high-throughput, practical and efficient tool for the discovery of functionally important genes responsible for certain phenotypes. In this review, we summarize the characterization of CRISPR/Cas9 system and applications of this new genetic toolkit in functional genetic screening. Keywords: CRISPR/Cas9, genome-scale knockout library, functional genetic screening ·综 述·
ISSN1000-3061CN11-1998Q生物工程学报 Chin J Biotech 随着科学技术的发展,人类基因组计划初能完全抑制基因表达,因此其造成的表型变化不 步完成,人们对基因的功能也有了一定的认识,够稳定明显,影响对基因功能的判定。此外, 但是仍然有更多的问题亟待探索,例如基因与疾细胞内源性的RNAi途径导致RNAi筛选存在着 病发生发展的关系,基因与肿瘤耐药性的关系广泛的脱靶效应,成为影响RNAi文库筛选的 等。如何利用人类基因组以及已有的技术手段研另一个重要问题。近年来 CRISPR-Cas9技术大放 究疾病发生发展过程,寻找与疾病和健康相关的异彩,可以用于酵母菌、哺乳动物细胞、斑马 功能性基因,从而建立新的疾病诊断预防和治疗鱼、水稻門、小鼠等各类细胞及生物体的基 方法,发现新的治疗靶点及开发新的药物,是科因编辑,科学家们也开始利用 CRISPR-Cas9技术 学家们关注的热点。高通量功能性基因筛选以基进行功能性基因的筛选。 CRISPR-Cas9技术既可 因编辑技术为基础,通过在全基因组范围内干扰通过诱导基因突变进行功能缺失型( Loss-of- 基因功能来筛选目的表型,是剖析基因功能、探 function)筛选,又可通过激活转录进行功能获得 索生物进程和疾病的重要工具。近年来,随着基型(Gain- of-function)筛选,不仅可以作用于基因 因编辑技术的发展和成熟,功能性基因筛选也随的编码区,还可以靶向基因非编码区山,与RNAi 之变得更加简便高效,在生命科学的研究中发挥技术相比具有相对较低的脱靶效率和更广泛的 了重要作用。本文主要介绍应用 CRISPR-Cas9作用位点,因而逐渐成为功能性基因筛选的热点 文库进行功能性基因筛选的方法及目前的研究方法。 进展 筛选功能性基因的常用策略主要分为功能获1 CRISPR-Cas9:精准的基因编辑技术 得型(Gain- of-function)筛选和功能缺失型(Loss CRISPR-Cas是广泛存在于细菌和古菌中的获 of-function)筛选。功能获得型筛选策略通常利用得性免疫系统,能够剪切外源基因,抵御病毒对细 DNA文库使基因过表达来筛选功能性基因。菌的入侵12,最早由 Ishino等发现于1987年 由于细胞转录组非常复杂,难以构建覆盖整个细直到2010年 CRISPR的机制和功能才被研究清 胞基因组的cDNA文库,导致cDNA文库的库容楚4。目前被发现的 CRISPR系统有3种类型 量有限;此外,cDNA的表达并不受细胞内在调均由3种元件组成:一簇 CRISPR相关基因(Cas)、 控,因此经常会出现基因异常高表达,影响对结非编码RNA以及一列重复序列。Cas基因可以 果的判断,这些都限制了cDNA文库在功能性基和核酸酶、解旋酶、聚合酶结合,是 CRISPR-Cas 因筛选中的应用。功能缺失型( Loss-of- function)系统中执行剪切功能的元件1。一系列短重复序 筛选策略是通过抑制基因表达或基因敲除来筛选列被来源于外源基因的间隔序列( Protospacer) 功能性基因。RNAi是真核生物细胞内广泛存在的隔开,共同构成了 CRISPR RNA( rrNA)阵列。 生物进程,通过 SiRNA介导其同源RNA降解实通常间隔序列与前间区序列邻近基序(PAM)相 现抑制靶基因表达的作用2,因而曾被广泛应用连。不同物种PAM序列不同,例如目前在哺 于高通量的功能缺失型基因筛选。与CDNA文乳动物细胞中应用广泛的spCa9识别5NGG 库相比,RNAi文库筛选具有高通量、简便、经济、PAM序列,而在细胞基因组中平均8-12bp就有 高效的优点,但是其仍然存在难以忽视的问题。这样的序列出现102。基因组中广泛存在的PAM RNAi技术是降低基因表达水平来影响表型,并不序列为 CRISPR-Cas9基因编辑技术应用于全基因 http://jourmals.im.ac.cn/cjben
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http://journals.im.ac.cn/cjbcn 462 随着科学技术的发展，人类基因组计划初 步完成，人们对基因的功能也有了一定的认识， 但是仍然有更多的问题亟待探索，例如基因与疾 病发生发展的关系，基因与肿瘤耐药性的关系 等。如何利用人类基因组以及已有的技术手段研 究疾病发生发展过程，寻找与疾病和健康相关的 功能性基因，从而建立新的疾病诊断预防和治疗 方法，发现新的治疗靶点及开发新的药物，是科 学家们关注的热点。高通量功能性基因筛选以基 因编辑技术为基础，通过在全基因组范围内干扰 基因功能来筛选目的表型，是剖析基因功能、探 索生物进程和疾病的重要工具。近年来，随着基 因编辑技术的发展和成熟，功能性基因筛选也随 之变得更加简便高效，在生命科学的研究中发挥 了重要作用。本文主要介绍应用 CRISPR-Cas9 文库进行功能性基因筛选的方法及目前的研究 进展。 筛选功能性基因的常用策略主要分为功能获 得型 (Gain-of-function) 筛选和功能缺失型 (Lossof-function) 筛选。功能获得型筛选策略通常利用 cDNA 文库使基因过表达来筛选功能性基因[1]。 由于细胞转录组非常复杂，难以构建覆盖整个细 胞基因组的 cDNA 文库，导致 cDNA 文库的库容 量有限；此外，cDNA 的表达并不受细胞内在调 控，因此经常会出现基因异常高表达，影响对结 果的判断，这些都限制了 cDNA 文库在功能性基 因筛选中的应用。功能缺失型 (Loss-of-function) 筛选策略是通过抑制基因表达或基因敲除来筛选 功能性基因。RNAi 是真核生物细胞内广泛存在的 生物进程，通过 siRNA 介导其同源 RNA 降解实 现抑制靶基因表达的作用[2]，因而曾被广泛应用 于高通量的功能缺失型基因筛选[3]。与 cDNA 文 库相比，RNAi 文库筛选具有高通量、简便、经济、 高效的优点，但是其仍然存在难以忽视的问题。 RNAi 技术是降低基因表达水平来影响表型，并不 能完全抑制基因表达，因此其造成的表型变化不 够稳定明显，影响对基因功能的判定[4]。此外， 细胞内源性的 RNAi 途径导致 RNAi 筛选存在着 广泛的脱靶效应[5]，成为影响 RNAi 文库筛选的 另一个重要问题。近年来 CRISPR- Cas9 技术大放 异彩，可以用于酵母菌[6]、哺乳动物细胞[7]、斑马 鱼[8]、水稻[9]、小鼠[10]等各类细胞及生物体的基 因编辑，科学家们也开始利用 CRISPR-Cas9 技术 进行功能性基因的筛选。CRISPR-Cas9 技术既可 通过诱导基因突变进行功能缺失型 (Loss-offunction) 筛选，又可通过激活转录进行功能获得 型 (Gain-of-function) 筛选，不仅可以作用于基因 的编码区，还可以靶向基因非编码区[11]，与 RNAi 技术相比具有相对较低的脱靶效率和更广泛的 作用位点，因而逐渐成为功能性基因筛选的热点 方法。 1 CRISPR-Cas9：精准的基因编辑技术 CRISPR-Cas 是广泛存在于细菌和古菌中的获 得性免疫系统，能够剪切外源基因，抵御病毒对细 菌的入侵[12]，最早由 Ishino 等发现于 1987 年[13]， 直到 2010 年 CRISPR 的机制和功能才被研究清 楚[14-16]。目前被发现的 CRISPR 系统有 3 种类型， 均由 3种元件组成：一簇 CRISPR相关基因 (Cas)、 非编码 RNA 以及一列重复序列[17]。Cas 基因可以 和核酸酶、解旋酶、聚合酶结合，是 CRISPR-Cas 系统中执行剪切功能的元件[18]。一系列短重复序 列被来源于外源基因的间隔序列 (Protospacer) 隔开，共同构成了 CRISPR RNA (crRNA) 阵列。 通常间隔序列与前间区序列邻近基序 (PAM) 相 连[19]。不同物种 PAM 序列不同，例如目前在哺 乳动物细胞中应用广泛的 spCas9 识别 5′-NGG PAM 序列，而在细胞基因组中平均 8–12 bp 就有 这样的序列出现[20-21]。基因组中广泛存在的 PAM 序列为 CRISPR-Cas9 基因编辑技术应用于全基因
李欢欢等基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展(463 组提供了可能。基因座上游是一段几百bp的非编基因的表达。 CRISPR激活 CRISPR activation 码基因,被命名为前导序列8。 CRISPR-Cas系 CRISPRa)是利用dCa9和转录激活因子协作上 统中最常用于基因编辑的是Ⅱ型 CRISPR-Cas系调靶基因表达水平,可以被应用于功能获得型 统,由Cas9核酸酶、 rrnA和反式激活 rrNA筛选{2。 ( tracrRNA)三部分组成12执行基因剪切功能 时,首先是cRNA转录为 pre-crRNA,同时与2 CRISPR-Ca9基因文库 rrNA互补的 tracrRNA也进行转录并激活Cas92.1基因文库设计 及特异性的RNA核酸酶对pre- rrNA进行加工, 目前研究者们已对如何将 CRISPR-Cas9系统 成熟的 rrNA与 tracrrNa及Cas9核酸酶形成复应用于功能性基因筛选进行了多种尝试并取得了 合体,进而在向导RNA的指导下靶向特定位点进成功(表1),为后来者提供了大量的经验和指导。 行切割23。研究者们将密码子优化的Cas9和必要 CRISPR-Cas9功能性基因筛选平台首先需要有能 的RNA元件在哺乳动物细胞中进行异源重组表够满足实验者需求的 CRISPR-Cas9文库。有效的 达,并将cRNA和 tracrRNA融合表达形成一条嵌gRNA是决定 CRISPR-Cas9功能性基因筛选成功 合单链向导RNA( SgRNA門2,精简了 CRISPR-Cas9的关键因素,因此首先要设计针对全基因组的 系统的结构,极大地提高了 CRISPR-Cas9系统应 SgRNA。设计 SgRNA要考虑两点:一是Cas9作用 用于基因编辑的可行性,使其更加便捷高效。在必需的PAM序列,二是降低脱靶效率。研究者 CRISPR-Cas9系统中, SgRNA和紧接着 SeRNA们开发了多种用于设计 SgRNA的平台。 Chuai等P 的PAM是决定基因编辑准确性的关键因素。总结了当前的36个设计 SgRNA的网站,并根据平 SgRNA长20nt,通过与靶序列互补配对引导Ca9台设计规则将其分为3类:1) Alignment-based:单 准确定位于靶基因,并在PAM上游约3bp处进纯依据PAM位置设计及评分;2) Hypothesis- 行DNA双链剪切1。断裂双链(DSBs)的 DNA driven:依据GC含量、外显子位置等因素对 损伤修复途径主要有以下两种:缺少修复模板时, SgRNA效率的作用设计及评分;3) Learning- 断裂双链通过非同源末端连接( Nonhomologous based:利用考虑影响 SgRNa效率的不同特点的 end joining,NHEJ)途径重新连接,这种过程容训练模式设计及评分。其中第二、三类平台在设 易产生插入或缺失突变使基因功能丧失,因而被计时考虑了不同序列和染色质特点,相比第一类 应用于基因敲除;当存在同源修复模板时,断裂双平台更加全面高效,使用者可根据不同要求选择 链通过同源直接修复( Homology- directed repair, 适合的平台。设计好的 SgRNA合成后需要连接至 HDR)途径将修复模板重组进断裂部位,常被用合适的慢病毒载体上,Cas9核酸酶既可以和 于基因重组。 CRISPR-Cas99技术除了可以进行 SgRNA构建在同一个质粒上,也可以构建在两 基因敲除,还可以用于基因的上调或下调表达。 个质粒上。将构建好的 SgRNA文库包装成慢病 CRISPR干扰( CRISPR interference, CRISPRI)和毒,并以低MOl(通常为03-0.5)感染细胞构建 RNAi功能相似,是在 CRISPR技术基础上改造而稳定细胞株29,避免同一细胞多个基因同时被敲 来的,将Cas9突变使其丧失活性( dead cas9, 除对结果造成影响。 dCas9)无法对双链DNA进行切割,再与转录抑2.2常用筛选方式 制因子联合作用,即可在 SgRNA指导下抑制特定 CRISPR-Cas9文库高通量筛选常用模式可以 :010-64807509 X: cjb@imaccn
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 ☏：010-64807509 ：cjb@im.ac.cn 463 组提供了可能。基因座上游是一段几百 bp 的非编 码基因，被命名为前导序列[18]。CRISPR-Cas 系 统中最常用于基因编辑的是Ⅱ型 CRISPR-Cas 系 统，由 Cas9 核酸酶、crRNA 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 三部分组成[22]。执行基因剪切功能 时，首先是 crRNA 转录为 pre-crRNA，同时与 crRNA 互补的 tracrRNA 也进行转录并激活 Cas9 及特异性的 RNA 核酸酶对 pre-crRNA 进行加工， 成熟的 crRNA 与 tracrRNA 及 Cas9 核酸酶形成复 合体，进而在向导 RNA 的指导下靶向特定位点进 行切割[23]。研究者们将密码子优化的 Cas9 和必要 的 RNA 元件在哺乳动物细胞中进行异源重组表 达[24]，并将 crRNA 和 tracrRNA 融合表达形成一条嵌 合单链向导 RNA (sgRNA)[25]，精简了 CRISPR-Cas9 系统的结构，极大地提高了 CRISPR-Cas9 系统应 用于基因编辑的可行性，使其更加便捷高效。在 CRISPR-Cas9 系统中，sgRNA 和紧接着 sgRNA 的 PAM 是决定基因编辑准确性的关键因素。 sgRNA 长 20 nt，通过与靶序列互补配对引导 Cas9 准确定位于靶基因，并在 PAM 上游约 3 bp 处进 行 DNA 双链剪切[17]。断裂双链 (DSBs) 的 DNA 损伤修复途径主要有以下两种：缺少修复模板时， 断裂双链通过非同源末端连接 (Nonhomologous end joining，NHEJ) 途径重新连接，这种过程容 易产生插入或缺失突变使基因功能丧失，因而被 应用于基因敲除；当存在同源修复模板时，断裂双 链通过同源直接修复 (Homology- directed repair， HDR) 途径将修复模板重组进断裂部位，常被用 于基因重组[20]。CRISPR-Cas9 技术除了可以进行 基因敲除，还可以用于基因的上调或下调表达。 CRISPR 干扰 (CRISPR interference，CRISPRi) 和 RNAi 功能相似，是在 CRISPR 技术基础上改造而 来的，将 Cas9 突变使其丧失活性 (dead Cas9， dCas9) 无法对双链 DNA 进行切割，再与转录抑 制因子联合作用，即可在 sgRNA 指导下抑制特定 基因的表达[26]。CRISPR 激活 (CRISPR activation， CRISPRa) 是利用 dCas9 和转录激活因子协作上 调靶基因表达水平，可以被应用于功能获得型 筛选[27]。 2 CRISPR-Cas9 基因文库 2.1 基因文库设计 目前研究者们已对如何将 CRISPR-Cas9 系统 应用于功能性基因筛选进行了多种尝试并取得了 成功 (表 1)，为后来者提供了大量的经验和指导。 CRISPR-Cas9 功能性基因筛选平台首先需要有能 够满足实验者需求的 CRISPR-Cas9 文库。有效的 sgRNA 是决定 CRISPR-Cas9 功能性基因筛选成功 的关键因素，因此首先要设计针对全基因组的 sgRNA。设计 sgRNA 要考虑两点：一是 Cas9 作用 必需的 PAM 序列，二是降低脱靶效率[17]。研究者 们开发了多种用于设计 sgRNA 的平台。Chuai 等[28] 总结了当前的 36 个设计 sgRNA 的网站，并根据平 台设计规则将其分为 3 类：1) Alignment-based：单 纯依据 PAM 位置设计及评分；2) Hypothesisdriven：依据 GC 含量、外显子位置等因素对 sgRNA 效率的作用设计及评分；3) Learningbased：利用考虑影响 sgRNA 效率的不同特点的 训练模式设计及评分。其中第二、三类平台在设 计时考虑了不同序列和染色质特点，相比第一类 平台更加全面高效，使用者可根据不同要求选择 适合的平台。设计好的 sgRNA 合成后需要连接至 合适的慢病毒载体上，Cas9 核酸酶既可以和 sgRNA 构建在同一个质粒上[29]，也可以构建在两 个质粒上[30]。将构建好的 sgRNA 文库包装成慢病 毒，并以低 MOI (通常为 0.3–0.5) 感染细胞构建 稳定细胞株[29]，避免同一细胞多个基因同时被敲 除对结果造成影响。 2.2 常用筛选方式 CRISPR-Cas9 文库高通量筛选常用模式可以
64ISsN10003061CN11-1998Q生物工程学报 Chin j Biotech 表1 CRISPR-Cas9系统在功能基因筛选中的应用 Table 1 Functional genetic screening using CRISPR-Cas system SgRNAS RNAs/gene Reference perturbation Cell type(s) Selection Human 64 751 10808 KO Resistance to Vemurafenib uman 73 151 711410 KO KBM7 Resistance to [34] Human 869 ela Resistance to diphtheria Resistance to chimaeric anthrax Human 91 320 172326 HPAF-Ⅱ Proliferation Human 23652 HELA A549 Proliferation 293T Mouse 67405 206113 NSCLC Proliferation Human 77 406 201213-4 KO Resistance to WNV [39] Human 187536 1854310 GXRCas9 Resistance to HIV [40] 234303 Activation A549 Resistance to IAV [41] Human l831 NF1:6682NF2:6934 A375 Resistance to 43] CUL3:4699 Vemurafenib Human 1247 67 Huh7.5 44] Human HBEl 28150 K562 Protein expression [45] 10739 HER2 Human 123 411 190506 CEM T Antigen antibody Raji/CD4B interactions 87897 1-5 KO IBMDMS GSDMD 49] 分为阳性筛选( Positive selection screen)和阴性果分析的平台。例如 MAGeCK是Li等开发的 筛选( Negative selection screen)。阳性筛选是用来分析 CRISPR高通量筛选结果的算法,之后 对已成功整合 SgRNA的细胞文库施加一定的筛L等又将其拓展为 MAGeCK-VISPR算法,为 选压力,仅使少数目的表型的细胞能够存活,达 CRISPR高通量筛选提供了综合质控、分析及可 到富集关键基因的目的。阴性筛选与之相反,存视化的数据分析方法。 活的细胞并不是目的表型细胞,因此需要比较不 同时间点 SgRNA的丰度找出差异gRNA来确定3 CRISPR-Cas9文库应用于功能性基因 关键基因。两种筛选方式通常都需要与高通量测筛选的研究进展 序技术结合,通过高通量测序获得样品中细胞的31药物作用基因筛选 SgRNA序列信息,再通过生物信息学分析排除假 CRISPR-Cas9文库早期应用于药物作用基因 阳性结果继而确定可能的候选基因(图1)。筛选的尝试较多。 Vemurafenib是突变的蛋白激酶 CRISPR系统后续分析同样是影响实验结果的重BRAF的抑制剂,被批准用于晚期黑色素瘤的治 要问题, Chuai等同样整理了7种用于后续结疗,对存在V600 E BRAF突变的黑色素瘤有治疗 http://jourmals.im.ac.cn/cjben
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http://journals.im.ac.cn/cjbcn 464 表 1 CRISPR-Cas9 系统在功能基因筛选中的应用 Table 1 Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Species sgRNAs Target genes sgRNAs/gene Type of perturbation Cell type(s) Selection Reference Human 64 751 10 808 3–4 KO A375 Resistance to Vemurafenib [9] Human 73 151 7 114 10 KO KBM7 Resistance to 6-thioguanine [34] Human 869 291 2–3 KO HeLa Resistance to diphtheria Resistance to chimaeric anthrax [35] Human 91 320 17 232 6 KO HPAF-Ⅱ Proliferation [36] Human 23 652 73 3 KO HELA A549 293T Proliferation [37] Mouse 67 405 20 611 3 KO NSCLC Proliferation [38] Human 77 406 20 121 3–4 KO 293FT Resistance to WNV [39] Human 187 536 18 543 10 KO GXRCas9 Resistance to HIV [40] Human 70 290 23 430 3 Activation A549 Resistance to IAV [41] Human 18 315 NF1: 6 682 NF2: 6 934 CUL3: 4 699 KO A375 Resistance to Vemurafenib [43] Human 12 472 671 20 KO Huh7.5 Proliferation [44] Human HBE1 10 739 HER2 12 189 281 433 50 30 Activation K562 Protein expression [45] Human 123 411 19 050 6 KO CEM T Raji/CD4 B Antigen antibody interactions [48] Mouse 87 897 19 150 1–5 KO iBMDMs GSDMD [49] 分为阳性筛选 (Positive selection screen) 和阴性 筛选 (Negative selection screen)[30]。阳性筛选是 对已成功整合 sgRNA 的细胞文库施加一定的筛 选压力，仅使少数目的表型的细胞能够存活，达 到富集关键基因的目的。阴性筛选与之相反，存 活的细胞并不是目的表型细胞，因此需要比较不 同时间点 sgRNA 的丰度找出差异 sgRNA 来确定 关键基因。两种筛选方式通常都需要与高通量测 序技术结合，通过高通量测序获得样品中细胞的 sgRNA 序列信息，再通过生物信息学分析排除假 阳性结果继而确定可能的候选基因 (图 1)。 CRISPR 系统后续分析同样是影响实验结果的重 要问题，Chuai 等[28]同样整理了 7 种用于后续结 果分析的平台。例如 MAGeCK 是 Li 等[31]开发的 用来分析 CRISPR 高通量筛选结果的算法，之后 Li 等又将其拓展为 MAGeCK-VISPR 算法[32]，为 CRISPR 高通量筛选提供了综合质控、分析及可 视化的数据分析方法。 3 CRISPR-Cas9 文库应用于功能性基因 筛选的研究进展 3.1 药物作用基因筛选 CRISPR-Cas9 文库早期应用于药物作用基因 筛选的尝试较多。Vemurafenib 是突变的蛋白激酶 BRAF 的抑制剂，被批准用于晚期黑色素瘤的治 疗，对存在 V600E BRAF 突变的黑色素瘤有治疗
李欢欢等基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展(465 Selection Deep sequencing remaining sgRNA Contro Deep sequencing gRNA library LenticrISPR library selection Selection Deep sequencing Campare change in III sgRNA counts 图 I CRISPR-Cas9系统功能基因筛选流程 Fig. 1 Flowchart of functional genetic screening using CRISPR-Cas 9 system 效果。 Shalem等设计了靶向全基因组18080个且每个基因至少设计了10条 SeRNA以确保文库 基因,包含64751条 sgRNA的 CRISPR-Cas9基因的 knockout效率。与 Shalem的方法略有差别的 敲除文库,并命名为 GeCKo( Genome- scale是,wang等并未采用单质粒的慢病毒载体系统 CRISPR-Cas9 knockout)文库。 Shalen等利用慢病而是先构建稳定表达Cas9的KBM7细胞,再转 毒载体将 GeCKo文库转染进有V600 E BRAF突染了整个 SgRNA文库。与单质粒系统相比,双质 变的黑色素瘤细胞A375中,加入 Vemurafenib抑粒系统可以通过挑选高效的Cas9表达细胞株来 制A375细胞生长,从而富集少数具有 Vemurafenib提高文库的 knockout效率。完成建库工作后研究 药物抗性的细胞。通过对这部分细胞的 SgRNA序者利用6-硫代鸟嘌呤的细胞致死作用,杀死MMR 列进行分析, Shalem等筛选出了n、 medI2、n、通路正常细胞,富集MMR通路突变细胞。对存 cw3、ada2b和 nadal等敲除后能够使细胞对活细胞的 SeRNA测序分析,研究者发现被富集细 lemurafenib产生抗性的基因,其中n/2、cul3、胞的 SgRNA主要靶向MMR通路的4个关键基因 tada2b和 nadal之前尚未被报道过与 Vemurafenib msh2、msh6、mlhl和pms2。 耐药性有关。这些候选基因提出了新的 Vemurafenib gRNA文库的构建是实现功能性基因筛选的 肿瘤耐药杋制假说。研究者还将筛选结果与之前使关键。覆盖全基因的文库虽然更加全面,但是由于 用RNA3筛选 Vemurafenib耐药基因的结果进行库容量庞大,在实际操作过程中需要大量的细胞 比较评估,两者结果高度一致,证明了 CRISPR-Cas9工作量及操作难度均较大。在研究炭疽毒素与白喉 用于功能性基因筛选的可行性。 毒素毒性作用相关基因的工作中,Zhou等3通过 同期,wang及其团队也采用了类似的筛选方对已掌握知识进行整理,挑选出了可能与研究内 式研究了DNA错配修复的相关基因。研究者容相关的291基因,并设计了靶向这291个基因 使用能够引起细胞损伤的核苷类似物6-硫代鸟嘌的包含869条 SgRNA的慢病毒聚焦型人源文库。 呤作为筛选抗性,MMR通路正常的细胞无法修该课题组使用炭疽毒素和白喉毒素分别进行阳性 复6-硫代鸟嘌呤引起的损伤而导致细胞滞留在筛选,经过三轮毒素处理,待对照组细胞全部死 G2-M期无法进行正常的分裂,而MMR缺陷细胞亡后,对实验组存活细胞进行测序分析。除了已 则不能识别这种损伤从而继续进行分裂。Wang等知的炭疽毒素受体 Antar1,研究者还成功鉴定 设计合成了靶向7114个基因的 SeRNA文库,并 penal、pecr、d10和CD8l等与炭疽毒素作用 :010-64807509 X: cjb@imaccn
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 ☏：010-64807509 ：cjb@im.ac.cn 465 图 1 CRISPR-Cas9 系统功能基因筛选流程 Fig. 1 Flowchart of functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system. 效果。Shalem 等[29]设计了靶向全基因组 18 080 个 基因，包含 64 751 条 sgRNA 的 CRISPR-Cas9 基因 敲除文库，并命名为 GeCKO (Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout) 文库。Shalem 等利用慢病 毒载体将 GeCKO 文库转染进有 V600E BRAF 突 变的黑色素瘤细胞 A375 中，加入 Vemurafenib 抑 制 A375 细胞生长，从而富集少数具有 Vemurafenib 药物抗性的细胞。通过对这部分细胞的 sgRNA 序 列进行分析，Shalem 等筛选出了 nf1、med12、nf2、 cul3、tada2b 和 tada1 等敲除后能够使细胞对 Vemurafenib 产生抗性的基因，其中 nf2、cul3、 tada2b 和 tada1 之前尚未被报道过与 Vemurafenib 耐药性有关。这些候选基因提出了新的 Vemurafenib 肿瘤耐药机制假说。研究者还将筛选结果与之前使 用 RNAi[33]筛选 Vemurafenib 耐药基因的结果进行 比较评估，两者结果高度一致，证明了CRISPR-Cas9 用于功能性基因筛选的可行性。 同期，Wang 及其团队也采用了类似的筛选方 式研究了 DNA 错配修复的相关基因[34]。研究者 使用能够引起细胞损伤的核苷类似物 6-硫代鸟嘌 呤作为筛选抗性，MMR 通路正常的细胞无法修 复 6-硫代鸟嘌呤引起的损伤而导致细胞滞留在 G2-M 期无法进行正常的分裂，而 MMR 缺陷细胞 则不能识别这种损伤从而继续进行分裂。Wang 等 设计合成了靶向 7 114 个基因的 sgRNA 文库，并 且每个基因至少设计了 10 条 sgRNA 以确保文库 的 knockout 效率。与 Shalem 的方法略有差别的 是，Wang 等并未采用单质粒的慢病毒载体系统， 而是先构建稳定表达 Cas9 的 KBM7 细胞，再转 染了整个 sgRNA 文库。与单质粒系统相比，双质 粒系统可以通过挑选高效的 Cas9 表达细胞株来 提高文库的 knockout 效率。完成建库工作后研究 者利用 6-硫代鸟嘌呤的细胞致死作用，杀死 MMR 通路正常细胞，富集 MMR 通路突变细胞。对存 活细胞的 sgRNA 测序分析，研究者发现被富集细 胞的 sgRNA 主要靶向 MMR 通路的 4 个关键基因 msh2、msh6、mlh1 和 pms2。 sgRNA 文库的构建是实现功能性基因筛选的 关键。覆盖全基因的文库虽然更加全面，但是由于 库容量庞大，在实际操作过程中需要大量的细胞， 工作量及操作难度均较大。在研究炭疽毒素与白喉 毒素毒性作用相关基因的工作中，Zhou 等[35]通过 对已掌握知识进行整理，挑选出了可能与研究内 容相关的 291 基因，并设计了靶向这 291 个基因 的包含 869 条 sgRNA 的慢病毒聚焦型人源文库。 该课题组使用炭疽毒素和白喉毒素分别进行阳性 筛选，经过三轮毒素处理，待对照组细胞全部死 亡后，对实验组存活细胞进行测序分析。除了已 知的炭疽毒素受体 Antxr1，研究者还成功鉴定 plxna1、pecr、fzd10 和 CD81 等与炭疽毒素作用
66ISsN10003061CN11-1998/Q生物工程学报 Chin j Biotech 机制相关的基因。已知白喉毒素相关基因hbe 细胞起作用,其作用机制是当肿瘤细胞中某个基 及新的与白喉毒素相关基因rab2α也被富集。这因发生突变时抑制另一基因表达,因而能够特异 种聚焦型的文库缩小了筛选范围,降低了操作难性地杀伤突变率高的肿瘤细胞而不影响正常细 度和实验成本,尤其适用于研究者对筛选功能基胞,这一作用方式被称为合成致死性。Shen等 因已有一定了解的情况。根据实际情况选择适合从这一思路出发,设计了双重gRNA文库筛选合 的文库容量能够更有效地进行文库筛选工作,提成致死相互作用网络。与一般的 SeRNA文库不同, 高实验成功率。 双重gRNA文库中每个载体包含两条gRNA,一条 3.2肿瘤功能基因筛选 靶向肿瘤细胞中高突变的肿瘤抑制基因,另一条靶 肿瘤是机体在遗传及环境等多重因素的影响向一种能够被肿瘤治疗药物抑制的基因。Shen等 下,致癌基因和抑癌基因发生突变而导致的细胞设计了靶向73对癌症基因,共计141912种基因 生长不受调控的疾病,严重威胁着人类的生命健组合的双重gRNA文库,并在人宫颈癌细胞、肺 康,引起了科学家的高度重视。运用高通量筛选癌细胞和人胚肾细胞中进行了筛选,通过检测不 技术鉴别参与肿瘤发生发展及转移的关键基因是同时间点gRNA丰度变化,进一步分析筛选出 研发抗肿瘤新药的重要手段。 CRISPR文库也被120种合成致死相互作用,为癌症新药的开发提 应用于胂瘤治疗靶点和新型抗肿瘤药物筛选,取供了新的靶点。 得了良好的成果。 CRISPR-Cas9功能性筛选技术也是研究肿瘤 胰腺癌生长快、转移率高且预后差,被称为生长与转移的重要工具之一。Chn等用包含 癌中之王”,其中胰腺导管腺癌(PDA)是胰腺癌67405条gRNA的基因文库诱变处理一种非转移 的一个主要的类型。 Steinhart等門选取了一株的鼠非小细胞肺癌细胞株,并将其移植于免疫缺 RNF43突变的胰腺导管腺癌细胞(PDAC)HPAFⅡ陷鼠身上,发现肿瘤很快就出现了转移。Chen等 来筛选胰腺癌新的治疗靶标。 Steinhart及其团队中将肺转移细胞与原发部位细胞进行测序比较 将靶向全基因组17232个基因的 TKO gRNA文库gRNA丰度变化,筛选出nP2、pEm、cn2a 转导进HPAF-Ⅱ细胞,通过对不同时间点细胞的Wm72、a、mR-345及mR152七个与肿瘤转移 SgRNA的丰度变化进行分析从而鉴别影响细胞增相关的基因。Chen等的工作证明了 CRISPR-Cas9 殖的基因。 Steinhart等鉴别出了2174个影响全基因组筛选不仅可以在各种细胞中开展,并且 HPAFⅡ细胞增殖的基因,其中参与Wmt信号通在体内也同样适用。Chen及其团队所提供的完整 路的FZD5,对PDAC的增殖具有重要的意义。 的体内筛选方案在之后也被更广泛地应用于各种 随后研究者还发现特异性结合FZD5和FZD的疾病的体内研究工作。与体外筛选相比,动物体 抗体能够抑制RNF43突变PDAC细胞生长,在肿内筛选模型具有更复杂的微环境,比体外更接近 瘤异种移植模型中也有类似作用,并且对RNF43真实的肿瘤微环境,从而有可能筛选到依赖于肿 突变的结直肠癌也有抑制效果。因此 Steinhart等瘤微环境的肿瘤抑制基因。 提出FZD5可以作为胰腺癌的潜在治疗靶点,基3.3病毒感染基因筛选 于 CRISPR的高通量功能性基因筛选是筛选细胞 许多疾病都与病毒感染相关,筛选出病毒受 表面特异性治疗靶标的有效手段。 体或病毒在宿主细胞中复制关键基因有助于开发 些抗肿瘤药物仅对发生特异性基因突变的新的传染病预防及治疗策略。西尼罗病毒(west http://jourmals.im.ac.cn/cjben
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http://journals.im.ac.cn/cjbcn 466 机制相关的基因。已知白喉毒素相关基因 hbegf 及新的与白喉毒素相关基因 rab2a 也被富集。这 种聚焦型的文库缩小了筛选范围，降低了操作难 度和实验成本，尤其适用于研究者对筛选功能基 因已有一定了解的情况。根据实际情况选择适合 的文库容量能够更有效地进行文库筛选工作，提 高实验成功率。 3.2 肿瘤功能基因筛选 肿瘤是机体在遗传及环境等多重因素的影响 下，致癌基因和抑癌基因发生突变而导致的细胞 生长不受调控的疾病，严重威胁着人类的生命健 康，引起了科学家的高度重视。运用高通量筛选 技术鉴别参与肿瘤发生发展及转移的关键基因是 研发抗肿瘤新药的重要手段。CRISPR 文库也被 应用于肿瘤治疗靶点和新型抗肿瘤药物筛选，取 得了良好的成果。 胰腺癌生长快、转移率高且预后差，被称为 “癌中之王”，其中胰腺导管腺癌 (PDA) 是胰腺癌 的一个主要的类型。Steinhart 等[36]选取了一株 RNF43 突变的胰腺导管腺癌细胞 (PDAC) HPAF-Ⅱ 来筛选胰腺癌新的治疗靶标。Steinhart 及其团队中 将靶向全基因组 17 232 个基因的 TKO gRNA 文库 转导进 HPAF-Ⅱ细胞，通过对不同时间点细胞的 sgRNA 的丰度变化进行分析从而鉴别影响细胞增 殖的基因。Steinhart 等鉴别出了 2 174 个影响 HPAF-Ⅱ细胞增殖的基因，其中参与 Wnt 信号通 路的 FZD5，对 PDAC 的增殖具有重要的意义。 随后研究者还发现特异性结合 FZD5 和 FZD8 的 抗体能够抑制 RNF43 突变 PDAC 细胞生长，在肿 瘤异种移植模型中也有类似作用，并且对 RNF43 突变的结直肠癌也有抑制效果。因此 Steinhart 等 提出 FZD5 可以作为胰腺癌的潜在治疗靶点，基 于 CRISPR 的高通量功能性基因筛选是筛选细胞 表面特异性治疗靶标的有效手段。 一些抗肿瘤药物仅对发生特异性基因突变的 细胞起作用，其作用机制是当肿瘤细胞中某个基 因发生突变时抑制另一基因表达，因而能够特异 性地杀伤突变率高的肿瘤细胞而不影响正常细 胞，这一作用方式被称为合成致死性。Shen 等[37] 从这一思路出发，设计了双重 gRNA 文库筛选合 成致死相互作用网络。与一般的 sgRNA 文库不同， 双重 gRNA 文库中每个载体包含两条 gRNA，一条 靶向肿瘤细胞中高突变的肿瘤抑制基因，另一条靶 向一种能够被肿瘤治疗药物抑制的基因。Shen 等 设计了靶向 73 对癌症基因，共计 141 912 种基因 组合的双重 gRNA 文库，并在人宫颈癌细胞、肺 癌细胞和人胚肾细胞中进行了筛选，通过检测不 同时间点 gRNA 丰度变化，进一步分析筛选出 120 种合成致死相互作用，为癌症新药的开发提 供了新的靶点。 CRISPR-Cas9 功能性筛选技术也是研究肿瘤 生长与转移的重要工具之一。Chen 等[38]用包含 67 405条 sgRNA的基因文库诱变处理一种非转移 的鼠非小细胞肺癌细胞株，并将其移植于免疫缺 陷鼠身上，发现肿瘤很快就出现了转移。Chen 等 将肺转移细胞与原发部位细胞进行测序比较 sgRNA 丰度变化，筛选出 nf2、pten、cdkn2a、 trim72、fga、miR-345 及 miR-152 七个与肿瘤转移 相关的基因。Chen 等的工作证明了 CRISPR-Cas9 全基因组筛选不仅可以在各种细胞中开展，并且 在体内也同样适用。Chen 及其团队所提供的完整 的体内筛选方案在之后也被更广泛地应用于各种 疾病的体内研究工作。与体外筛选相比，动物体 内筛选模型具有更复杂的微环境，比体外更接近 真实的肿瘤微环境，从而有可能筛选到依赖于肿 瘤微环境的肿瘤抑制基因。 3.3 病毒感染基因筛选 许多疾病都与病毒感染相关，筛选出病毒受 体或病毒在宿主细胞中复制关键基因有助于开发 新的传染病预防及治疗策略。西尼罗病毒 (West
李欢欢等/基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展 Nile virus,WNV)是一种脑炎病毒,能够引起急 sulfotransferase2,TPST2)和溶质家族35成员 性神经感染并导致大量神经元细胞死亡。为了研B2( Solute carrier family35 member B2,SLC35B2 究WNV导致细胞死亡的机制,Ma及其团队对CCR5进行修饰以便于与HV结合。另一种基 构建了靶向人类基因组20121个基因的 SgRNA因编码白细胞粘附因子( Activated leukocyte cell 文库,并将每条 SeRNA的靶点都设计在转录起始 adhesion molecule, ALCAM),与HV在细胞间 位点附近以确保基因能够被完全敲除。Ma等将构的传播相关。筛选出的5个基因被敲除后均不影 建好的文库转导进293FT细胞中,并感染WNV响T细胞的存活,但能够使T细胞抵抗HIV的感 病毒株进行了第一轮筛选。Ma等对第一轮筛选结染,因此可以作为HV治疗的潜在靶标,为预防 果进行分析,发现有部分丰度较高的 SgRNA其靶和治疗艾滋病提供新的理念和途径。 向基因的其他 SgRNA并未被富集,这些结果可能 目前功能缺失型( LosS-of- function)筛选已 是由假阳性造成的。因此Ma及其团队又针对初被广泛应用于寻找病毒感染、复制和传播所需基 次实验结果富集到的 SgRNA设计了亚基因敲除因,但过表达基因影响病毒感染的研究还比较欠 文库进行重复实验,最终筛选出7个与WNV诱缺。基于此 Heaton等H应用 CRISPR协同激活调 导细胞死亡相关的关键基因:emc2、emc3、 selll节( CRISPR synergistic activation mediator, CRISPR derl2、ubeg2、ube》和 hrdI e。硏究者证实了敲SAM)技术筛选过表达后抑制甲型流感病毒(IVA) 除这些基因能够有效保护细胞不被WNV杀死,感染的基因。研究者首先将dCas9-VP64融合蛋白 这7个基因可以作为新的治疗靶点以降低WNV和MS2p65HSF1转录因子转导进A549CR细胞 导致的机体损伤。 中,并将靶向全基因组23430个基因转录起始位 HV引发的艾滋病(AIDS)严重威胁着人类点上游200bp处的 SgRNA文库导入转录激活效 生命健康,阐明HⅣV突破宿主细胞防御系统的分率最髙的细胞株,促进基因的过表达。之后研究 子机制,开发HIⅤ治疗的新靶点,进而提出新的者用IVA感染细胞,通过流式分选出未被病毒感 HⅤ防治策略,具有非常重大的理论意义和实际染的细胞进行测序分析,发现靶向b4galn2基因 应用价值。Pak等为了阐明HV在T细胞上的的sRNA丰度最高。经过多重验证, Heaton等证 受体,设计了适用于 CRISPR筛选的CD4T细胞明了b48a2过表达能够限制多种亚型的甲型流 ( GXRCas9细胞)筛选模型,并用包含187536条感病毒感染,未来可能被应用于防治人流感及禽 SgRNA(靶向18543个基因)的慢病毒文库感染流感。 该细胞,获得了超过18万种缺失不同受体的T 为了研究影响溶瘤病毒感染及杀伤肿瘤细胞 细胞库。之后研究人员用HⅤ病毒株JR-CSF感的关键基因,我们同样采用基于 GeCKO v全基 染这些缺失不同受体的T细胞,随后通过流式分因组敲除文库的功能缺失型( LoSs-of- function) 选GFP阴性和阳性的T细胞(被病毒感染的细胞筛选方法。我们尝试了两种筛选方案:第一种是 能够检测到GFP的表达),并对GFP阴性细胞群阵列筛选( Arrayed screen),即将已成功转导 与未感染HⅣⅤ病毒细胞测序,分析两群细胞 GeCKo v2文库的病毒抵抗型细胞分人96孔板 SgRNA的丰度差异,最终发现了5个 SgRNA丰度通过免疫斑点法检测病毒复制情况,挑选病毒复 变化最大的基因。其中CD4和CCR5是HⅣⅤ感染制提高的孔进行下一步验证;第二种方法是合并 T细胞的受体,酪蛋白磺基转移酶2( Tyrosylprotein筛选( Pooled screen),即将成功转导 GeCKo v :010-64807509 X: cjb@imaccn
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 ☏：010-64807509 ：cjb@im.ac.cn 467 Nile virus，WNV) 是一种脑炎病毒，能够引起急 性神经感染并导致大量神经元细胞死亡。为了研 究 WNV 导致细胞死亡的机制，Ma 及其团队[39] 构建了靶向人类基因组 20 121 个基因的 sgRNA 文库，并将每条 sgRNA 的靶点都设计在转录起始 位点附近以确保基因能够被完全敲除。Ma 等将构 建好的文库转导进 293FT 细胞中，并感染 WNV 病毒株进行了第一轮筛选。Ma 等对第一轮筛选结 果进行分析，发现有部分丰度较高的 sgRNA 其靶 向基因的其他 sgRNA 并未被富集，这些结果可能 是由假阳性造成的。因此 Ma 及其团队又针对初 次实验结果富集到的 sgRNA 设计了亚基因敲除 文库进行重复实验，最终筛选出 7 个与 WNV 诱 导细胞死亡相关的关键基因：emc2、emc3、sel1l、 derl2、ubeg2、ube2j1 和 hrd1。研究者证实了敲 除这些基因能够有效保护细胞不被 WNV 杀死， 这 7 个基因可以作为新的治疗靶点以降低 WNV 导致的机体损伤。 HIV 引发的艾滋病 (AIDS) 严重威胁着人类 生命健康，阐明 HIV 突破宿主细胞防御系统的分 子机制，开发 HIV 治疗的新靶点，进而提出新的 HIV 防治策略，具有非常重大的理论意义和实际 应用价值。Park 等[40]为了阐明 HIV 在 T 细胞上的 受体，设计了适用于 CRISPR 筛选的 CD4+ T 细胞 (GXRCas9 细胞) 筛选模型，并用包含 187 536 条 sgRNA (靶向 18 543 个基因) 的慢病毒文库感染 该细胞，获得了超过 18 万种缺失不同受体的 T 细胞库。之后研究人员用 HIV 病毒株 JR-CSF 感 染这些缺失不同受体的 T 细胞，随后通过流式分 选 GFP 阴性和阳性的 T 细胞 (被病毒感染的细胞 能够检测到 GFP 的表达)，并对 GFP 阴性细胞群 与未感染 HIV 病毒细胞测序，分析两群细胞 sgRNA 的丰度差异，最终发现了 5 个 sgRNA 丰度 变化最大的基因。其中 CD4 和 CCR5 是 HIV 感染 T 细胞的受体，酪蛋白磺基转移酶 2 (Tyrosylprotein sulfotransferase 2，TPST2) 和溶质家族 35 成员 B2 (Solute carrier family 35 member B2，SLC35B2) 对 CCR5 进行修饰以便于与 HIV 结合。另一种基 因编码白细胞粘附因子 (Activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)，与 HIV 在细胞间 的传播相关。筛选出的 5 个基因被敲除后均不影 响 T 细胞的存活，但能够使 T 细胞抵抗 HIV 的感 染，因此可以作为 HIV 治疗的潜在靶标，为预防 和治疗艾滋病提供新的理念和途径。 目前功能缺失型 (Loss-of-function) 筛选已 被广泛应用于寻找病毒感染、复制和传播所需基 因，但过表达基因影响病毒感染的研究还比较欠 缺。基于此 Heaton 等[41]应用 CRISPR 协同激活调 节 (CRISPR synergistic activation mediator，CRISPR SAM) 技术筛选过表达后抑制甲型流感病毒 (IVA) 感染的基因。研究者首先将 dCas9-VP64 融合蛋白 和 MS2-p65-HSF1 转录因子转导进 A549-CR 细胞 中，并将靶向全基因组 23 430 个基因转录起始位 点上游 200 bp 处的 sgRNA 文库导入转录激活效 率最高的细胞株，促进基因的过表达。之后研究 者用 IVA 感染细胞，通过流式分选出未被病毒感 染的细胞进行测序分析，发现靶向 b4galnt2 基因 的 sgRNA 丰度最高。经过多重验证，Heaton 等证 明了 b4galnt2 过表达能够限制多种亚型的甲型流 感病毒感染，未来可能被应用于防治人流感及禽 流感。 为了研究影响溶瘤病毒感染及杀伤肿瘤细胞 的关键基因，我们同样采用基于 GeCKO v2 全基 因组敲除文库的功能缺失型 (Loss-of-function) 筛选方法。我们尝试了两种筛选方案：第一种是 阵列筛选 (Arrayed screen)，即将已成功转导 GeCKO v2 文库的病毒抵抗型细胞分入 96 孔板， 通过免疫斑点法检测病毒复制情况，挑选病毒复 制提高的孔进行下一步验证；第二种方法是合并 筛选 (Pooled screen)，即将成功转导 GeCKO v2
ISSN1000-3061CN11-1998Q生物工程学报 Chin J Biotech 文库的细胞感染病毒,利用高通量测序分析病毒链非编码RNA的基因进行了功能筛选。 pgRNA 感染后细胞 SeRNA丰度变化情况。与合并筛选相是一对靶向不同位点的 SgRNA,能够在同一基因 比,阵列筛选每孔细胞数较少,因此在培养过程的不同位点造成双链断裂,因此有可能产生大片 中易出现 SgRNA丢失的情况,同时实验结果还与段的缺失,造成可观察的表型变化。为了验证 用于检测病毒复制抗体的亲和性有关,容易出现 pgRNA的有效性,研究人员设计了靶向cspg4基 假阳性,降低了实验的准确性,且该方法工作量因座的 pgRNA,使用双U6启动子分别启动两个 较大,操作难度高。合并筛选是较为便捷准确的gRNA的表达,结果表明所有的6对 pgRNA均能 筛选方式,需要注意的是筛选所用细胞的选择,够对基因正确切割。基于此,Zhu等针对 可依据正向筛选和负向筛选分别选择病毒敏感型Huh7.5OC中的近700个癌症或其他疾病相关长 细胞和病毒抵抗型细胞 链非编码RNA设计了gRNA,剔除其中特异性和 3.4非编码基因功能研究 效率较低的gRNA及靶向启动子和外显子的 基因组中大多数DNA并不编码蛋白质,但gRNA,获得了可用于筛选的基因文库。之后研究 却与基因表达调控密切相关,研究表明超过90%者将文库转导进稳定表达Cas9的Huh7.50C,持 遗传变异相关疾病发生在基因非编码区域H。阐续培养30d后对 CRISPR筛选前和筛选后的细胞 明这些非编码基因如何参与基因表达调控有助于测序分析来鉴定能够影响细胞增殖和生存的 人们更好地研究基因异常导致的疾病。在之前的 ncRNA。经过多重的验证,Zhu等鉴定出了51个 工作中, Shalem等四利用 CRISPR-Cas9文库发与肿瘤细胞增殖相关的非编码RNA,证实了利用 现了mn、n、cln3等功能缺失后使黑色素瘤细 pgRNA研究 ncRNA的方法具有较高的精确性和 胞对 Vemurafenib产生抗性的基因。在此基础上,特异性。同时,研究人员在Hela细胞中的重复实 Sanjana等设计了3个分别靶向cu3,m/和n/2验结果也证明了这一点。但是这一筛选策略仍存 基因5端和3端紧邻的100kb范围内基因区域的在一些问题。首先删除 IncANa可能影响邻近功 SgRNA文库,来研究非编码区对相关基因的调控能元件如增强子和 micrornA的功能,因此需要 机制。 Sanjana等将 SgRNA文库转导进BRAF突在设计 pgRNA时尽可能地排除靶向增强子和 变的A375细胞中,将 Vemurafenib处理后的存 microrna区域的gRNA。由于 pgRNA间具有相 活细胞测序分析。研究者对富集 SgRNA最多的同的U6启动子和3支架序列,不同的 pgRNA间 cul3基因进行了重点分析,发现在cul3基因周围有可能(约7.5%)会发生重组导致错误的配对 有24个基因位点突变能够导致cul3表达降低。使用不同的U6启动子和3支架序列可以降低重 Sanjana及其团队的工作证明了 CRISPR-Cas9文组率。此外,这种筛选策略并不能揭示 IncANA 库不仅可以用于筛选功能性基因,还可以用来研的调节机制,还需要后续的工作进行探究。 究非编码基因功能。 Klann及其团队4介绍了一种以 CRISPR 对于非编码长链RNA( Incana),插入或缺失Cas9技术为基础的表观遗传调节元件筛选方法 突变导致的变化可能并不足以产生明显的表型变 CERES)。识别调节元件所有可能的转录因子结 化。针对这一情况,Zhu等设计了配对向导RNA合位点需要针对该调节元件区域设计高密度的 ( Paired- guide RNA, pgRNA),对人肝癌细胞系 SgRNA。然而在许多基因区域PAM序列可能并不 Huh7.50C中的近700个癌症或其他疾病相关长在转录因子结合位点,导致 SgRNA不能充分覆盖 http://jourmals.im.ac.cn/cjben
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http://journals.im.ac.cn/cjbcn 468 文库的细胞感染病毒，利用高通量测序分析病毒 感染后细胞 sgRNA 丰度变化情况。与合并筛选相 比，阵列筛选每孔细胞数较少，因此在培养过程 中易出现 sgRNA 丢失的情况，同时实验结果还与 用于检测病毒复制抗体的亲和性有关，容易出现 假阳性，降低了实验的准确性，且该方法工作量 较大，操作难度高。合并筛选是较为便捷准确的 筛选方式，需要注意的是筛选所用细胞的选择， 可依据正向筛选和负向筛选分别选择病毒敏感型 细胞和病毒抵抗型细胞。 3.4 非编码基因功能研究 基因组中大多数 DNA 并不编码蛋白质，但 却与基因表达调控密切相关，研究表明超过 90% 遗传变异相关疾病发生在基因非编码区域[42]。阐 明这些非编码基因如何参与基因表达调控有助于 人们更好地研究基因异常导致的疾病。在之前的 工作中，Shalem 等[29]利用 CRISPR-Cas9 文库发 现了 nf1、nf2、clu3 等功能缺失后使黑色素瘤细 胞对 Vemurafenib 产生抗性的基因。在此基础上， Sanjana 等[43]设计了 3 个分别靶向 cul3、nf1 和 nf2 基因 5′端和 3′端紧邻的 100 kb 范围内基因区域的 sgRNA 文库，来研究非编码区对相关基因的调控 机制。Sanjana 等将 sgRNA 文库转导进 BRAF 突 变的 A375 细胞中，将 Vemurafenib 处理后的存 活细胞测序分析。研究者对富集 sgRNA 最多的 cul3 基因进行了重点分析，发现在 cul3 基因周围 有 24 个基因位点突变能够导致 cul3 表达降低。 Sanjana 及其团队的工作证明了 CRISPR-Cas9 文 库不仅可以用于筛选功能性基因，还可以用来研 究非编码基因功能。 对于非编码长链 RNA (lncRNA)，插入或缺失 突变导致的变化可能并不足以产生明显的表型变 化。针对这一情况，Zhu 等[44]设计了配对向导 RNA (Paired-guide RNA，pgRNA)，对人肝癌细胞系 Huh7.5OC 中的近 700 个癌症或其他疾病相关长 链非编码 RNA 的基因进行了功能筛选。pgRNA 是一对靶向不同位点的 sgRNA，能够在同一基因 的不同位点造成双链断裂，因此有可能产生大片 段的缺失，造成可观察的表型变化。为了验证 pgRNA 的有效性，研究人员设计了靶向 cspg4 基 因座的 pgRNA，使用双 U6 启动子分别启动两个 gRNA 的表达，结果表明所有的 6 对 pgRNA 均能 够对基因正确切割。基于此， Zhu 等针对 Huh7.5OC 中的近 700 个癌症或其他疾病相关长 链非编码 RNA 设计了 gRNA，剔除其中特异性和 效率较低的 gRNA 及靶向启动子和外显子的 gRNA，获得了可用于筛选的基因文库。之后研究 者将文库转导进稳定表达 Cas9 的 Huh7.5OC，持 续培养 30 d 后对 CRISPR 筛选前和筛选后的细胞 测序分析来鉴定能够影响细胞增殖和生存的 lncRNA。经过多重的验证，Zhu 等鉴定出了 51 个 与肿瘤细胞增殖相关的非编码 RNA，证实了利用 pgRNA 研究 lncRNA 的方法具有较高的精确性和 特异性。同时，研究人员在 Hela 细胞中的重复实 验结果也证明了这一点。但是这一筛选策略仍存 在一些问题。首先删除 lncRNA 可能影响邻近功 能元件如增强子和 microRNA 的功能，因此需要 在设计 pgRNA 时尽可能地排除靶向增强子和 microRNA 区域的 gRNA。由于 pgRNA 间具有相 同的 U6 启动子和 3′支架序列，不同的 pgRNA 间 有可能 (约 7.5%) 会发生重组导致错误的配对， 使用不同的 U6 启动子和 3′支架序列可以降低重 组率。此外，这种筛选策略并不能揭示 lncRNA 的调节机制，还需要后续的工作进行探究。 Klann 及其团队[45]介绍了一种以 CRISPRCas9 技术为基础的表观遗传调节元件筛选方法 (CERES)。识别调节元件所有可能的转录因子结 合位点需要针对该调节元件区域设计高密度的 sgRNA。然而在许多基因区域 PAM 序列可能并不 在转录因子结合位点，导致 sgRNA 不能充分覆盖
李欢欢等基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展(469 所有的转录因子结合位点。因此 Klann等选用了细胞及HTLV-1感染细胞表面的病毒生物膜结合。 转录抑制的dCas9KRAB酶和转录激活的 Zotova等的研究思路是在BF4阳性细胞上转导 dCas9p300酶。dCas9KRAB是将KRAB( Kruppel- CRISPR knockout文库,分选出阴性细胞,即可 associated box)区域与dCas9融合表达,招募使能是BF4抗原被敲除的细胞。基于这样的思路研 组蛋白H3K9发生甲基化的蛋白进而形成异染色究者在CEMT和 Raji/cd4B细胞上转导 GeCKo 质导致靶序列上的基因抑制。E1A相关蛋白文库,并将不与BF4结合的细胞分选出来。经过 p300组蛋白乙酰转移酶核心区与dCas9融合后能两轮的重复分选,阴性细胞比例达到了99%以上 够结合到靶DNA增强子或启动子上,促进组蛋研究人员对这部分细胞进行测序分析,发现约 白H3K27发生乙酰化,从而促使基因激活4。这80%的sRNA靶向CD82,经过验证,证实了BF4 两种方法即使在转录因子结合位点没有PAM序确实是CD82特异性抗体。在筛选抗体靶标的研 列的情况下仍然能够对调节元件活性进行调节。究中还有一些需要注意的地方,首先这种筛选方 研究人员根据人白血病细胞系K562 DNase-seq数式不适合筛选抗体抗原是细胞生存所需的基因, 据设计了针对β- globin基因座周围45Mb区域的因为这部分基因被敲除后会导致细胞无法存活而 10739条 SeRNA。这些 SgRNA靶向该区域281个丢失,无法在后续的分选工作中被鉴定出。Cas9 DNase I超敏感位点( DNase I hypersensitive sites,文库的代表性和多样性也是需要关注的问题,不 DHSS)。研究者将构建好的 SgRNA导入改造过的同的细胞和慢病毒载体都会对此造成影响。 细胞(B- globin的转录与荧光蛋白相关联)中,并分 Shi及其团队14在Nate上发表了关于细胞 别将荧光表达最高和最低的10%细胞分选出来分焦亡机制的相关研究。细胞焦亡是机体在感知病 析 SeRNA的相对丰度变化。Klan及其团队的工原微生物浸染后启动的免疫防御反应,炎症激活 作为高通量注释调节元件的作用提高了效率。 的 caspase-l和识别细菌脂多糖的 caspase-4 3.5其他工作 caspase-5和 caspase-ll都能够引起细胞焦亡,但 除了应用于肿瘤、病毒、非编码RNA的相关是其机制仍然未知。研究人员首先建立了脂多糖 功能基因研究外, CRISPR-Cas9高通量筛选在抗LPS)电转方法,使LPS能够诱导90%以上的细 体靶标筛选、细胞信号通路硏究等生物医学的其胞焦亡。接着在能够对脂多糖刺激正常反应的 他领域中也有着广泛的应用。 Tlr4骨髓源永生化巨噬细胞( IBMDMS)转导 单克隆抗体特异性靶标抗原及其表位的识别 CRISPR knockout基因文库,将脂多糖刺激细胞 是抗体硏究中的重要工作。传统的抗原特异性鉴焦亡后存活的细胞测序分析。分析结果显示,靶 别方式是 Western blotting(蛋白印迹)和向 gasdermin D( GSDMD)基因的5条 SgRNA中 Immunoprecipitation(免疫沉淀),但是当抗体不能有4条在富集到的前30中,其中有2条在前10。 被 Western blotting和 Immunoprecipitation检测到后续的结果进一步证明了 GSDMD的N端能够诱 时,就需要使用基于基因的技术来鉴定抗体靶标。导细胞焦亡。在此研究中,研究人员利用 CRISPR Zooa等以MT2细胞(人T细胞嗜淋巴病毒基因文库进行了全基因组范围的遗传筛选,成功 型 HTLV-1慢性感染T细胞)作为免疫原免疫地筛选到了敵除后能够抑制细胞焦亡的基因 小鼠获得了一株HILV-1生物膜特异性单克隆抗 GSDMD,并阐明了 GSDMD作为炎症 caspase底物 体BF4。BF4能够和未感染的淋巴细胞、中性粒蛋白,在被切割后能够引发细胞焦亡的分子机制。 :010-64807509 X: cjb@imaccn
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 ☏：010-64807509 ：cjb@im.ac.cn 469 所有的转录因子结合位点。因此 Klann 等选用了 转录抑制的 dCas9KRAB 酶和转录激活的 dCas9p300 酶。dCas9KRAB 是将 KRAB (Krüppelassociated box) 区域与 dCas9 融合表达，招募使 组蛋白 H3K9 发生甲基化的蛋白进而形成异染色 质导致靶序列上的基因抑制[46]。E1A 相关蛋白 p300 组蛋白乙酰转移酶核心区与 dCas9 融合后能 够结合到靶 DNA 增强子或启动子上，促进组蛋 白 H3K27 发生乙酰化，从而促使基因激活[47]。这 两种方法即使在转录因子结合位点没有 PAM 序 列的情况下仍然能够对调节元件活性进行调节。 研究人员根据人白血病细胞系 K562 DNase-seq数 据设计了针对-globin 基因座周围 4.5 Mb 区域的 10 739 条 sgRNA。这些 sgRNA 靶向该区域 281 个 DNaseⅠ超敏感位点 (DNaseⅠhypersensitive sites， DHSs)。研究者将构建好的 sgRNA 导入改造过的 细胞 (-globin 的转录与荧光蛋白相关联) 中，并分 别将荧光表达最高和最低的 10%细胞分选出来分 析 sgRNA 的相对丰度变化。Klann 及其团队的工 作为高通量注释调节元件的作用提高了效率。 3.5 其他工作 除了应用于肿瘤、病毒、非编码 RNA 的相关 功能基因研究外，CRISPR-Cas9 高通量筛选在抗 体靶标筛选、细胞信号通路研究等生物医学的其 他领域中也有着广泛的应用。 单克隆抗体特异性靶标抗原及其表位的识别 是抗体研究中的重要工作。传统的抗原特异性鉴 别方式是 Western blotting ( 蛋白印迹 ) 和 Immunoprecipitation (免疫沉淀)，但是当抗体不能 被 Western blotting 和 Immunoprecipitation 检测到 时，就需要使用基于基因的技术来鉴定抗体靶标。 Zotova 等[48]以 MT2 细胞 (人 T 细胞嗜淋巴病毒 Ⅰ型 HTLV-1 慢性感染 T 细胞) 作为免疫原免疫 小鼠获得了一株 HTLV-1 生物膜特异性单克隆抗 体 BF4。BF4 能够和未感染的淋巴细胞、中性粒 细胞及 HTLV-1 感染细胞表面的病毒生物膜结合。 Zotova 等的研究思路是在 BF4 阳性细胞上转导 CRISPR knockout 文库，分选出阴性细胞，即可 能是 BF4 抗原被敲除的细胞。基于这样的思路研 究者在 CEM T 和 Raji/CD4 B 细胞上转导 GeCKO 文库，并将不与 BF4 结合的细胞分选出来。经过 两轮的重复分选，阴性细胞比例达到了 99%以上。 研究人员对这部分细胞进行测序分析，发现约 80%的 sgRNA 靶向 CD82，经过验证，证实了 BF4 确实是 CD82 特异性抗体。在筛选抗体靶标的研 究中还有一些需要注意的地方，首先这种筛选方 式不适合筛选抗体抗原是细胞生存所需的基因， 因为这部分基因被敲除后会导致细胞无法存活而 丢失，无法在后续的分选工作中被鉴定出。Cas9 文库的代表性和多样性也是需要关注的问题，不 同的细胞和慢病毒载体都会对此造成影响。 Shi 及其团队[49]在 Nature 上发表了关于细胞 焦亡机制的相关研究。细胞焦亡是机体在感知病 原微生物浸染后启动的免疫防御反应，炎症激活 的 caspase-1 和识别细菌脂多糖的 caspase-4、 caspase-5 和 caspase-11 都能够引起细胞焦亡，但 是其机制仍然未知。研究人员首先建立了脂多糖 (LPS) 电转方法，使 LPS 能够诱导 90%以上的细 胞焦亡。接着在能够对脂多糖刺激正常反应的 Tlr4–/–骨髓源永生化巨噬细胞 (iBMDMs) 转导 CRISPR knockout 基因文库，将脂多糖刺激细胞 焦亡后存活的细胞测序分析。分析结果显示，靶 向 gasdermin D (GSDMD) 基因的 5 条 sgRNA 中， 有 4 条在富集到的前 30 中，其中有 2 条在前 10。 后续的结果进一步证明了 GSDMD 的 N 端能够诱 导细胞焦亡。在此研究中，研究人员利用 CRISPR 基因文库进行了全基因组范围的遗传筛选，成功 地筛选到了敲除后能够抑制细胞焦亡的基因 GSDMD，并阐明了 GSDMD 作为炎症 caspase 底物 蛋白，在被切割后能够引发细胞焦亡的分子机制
470ISSN10003061CN11998Q生物工程学报 Chin j Biotech 4结语 3 Mohr SE, Smith JA, Shamu CE, et al. RNAi screening techniques and complementary CRISPR-Cas9技术作为近年来热门的基因编 approaches. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(9) 辑技术,凭借其精准、简便、高效的特点受到众 91-600. 多研究者的关注,短短几年间已成为基因编辑领 [4] Sachse C, Krausz E, Kronke A, et al. High-throughput RNA interference strategic 域中最热门的技术,被广泛应用于生物、医学等 validation by using synthetic short interfering RNAs 领域。基于 CRISPR-Cas9的高通量功能性筛选技 functional genomics investigations of biological 术也逐渐取代了RNAi和cDNA文库,为功能基 athways. Methods Enzymol, 2005, 392: 242-277 [5] Qiu SB, Adema CM, Lane T. A computational study of 因的研究提供了高通量高效率的筛选工具。尽管 off-target effects of RNa interference. Nucleic Acids 与传统的筛选方法相比, CRISPR-Cas9更加高效 Res,2005,33(6:1834-1847 可靠且特异性更高,但其仍然存在一些问题,其6 Gratz s, wildonger J, Harrison MM,etal 中最令人关注的就是脱靶效率。 CRISPR-Cas9系 CRISPR/Cas9-mediated genome engineering promise of designer flies on demand. Fly(Austin), 2013, 统依据20nt的 SgRNA定位靶基因,因此有可能 7(4):249-255 由于错配而出现脱靶问题。除了设计特异性更高[7] Jinek M, East A, Cheng A,etal!RNA- programmed 的 SgRNA外,研究者们提供了其他的降低脱靶效 genome editing in human cells. eLife, 2013, 2: e00471 [8]Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, et al. Efficient 率的策略。例如可以使用只切开DNA双链一侧 CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects 的 Cas 9n切口酶5,需要一对 SgRNA才能完成 in zebrafish Development, 2013, 140(24): 4982-4987 DNA双链剪切,因此可以降低脱靶效率。 Vidigal[ 9] Shan QW, Wang YP, Li J,etal. Targeted genome 等5则是将20nt的 SgRNA缩短为17nt,剪切效 modification of crop plants using a CRiSPR-Cas system. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 686-688 率不变而脱靶效率降低。另一种策略是将dCas9[ 10] Fujii w, Onuma A, Sugiura K, et al. Efficient generation 与FokI核酸酶融合表达来提高筛选特异性321 of genome- modified mice via offset-nicking by 这些方法虽然能够降低脱靶效率,但是还需要进 CRISPR/Cas system. Biochem Biophys Res Commun, 2014 一步改进才能应用于高通量的功能性基因筛选。 I Shalem O, Sanjana NE, Zhang F. High-throughpu 基于 CRISPR-Cas9功能性基因筛选技术已经 functional genomics using CRISPR-Cas. Nat Rev 在细胞生存必需基因鉴定、药物或毒素抗性基因 Genet,2015,16(5):299-311. 筛选、潜在治疗靶标筛选、肿瘤转移等相关基因21 Wei CX. LiuⅣ,yzs,etal. TALENσ Cas9-rapid, efficient and specific choices for genome modifications. 筛选方面取得了重要进展,为开发有效的靶点特 J Genet Genomics, 2013, 40(6): 281-289. 异性治疗药物奠定了基础,未来也必然会推动整3] shino Y, Shinagawa h, Makino K,etal. Nucleotide 个生命科学的快速发展。 sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol, 1987, REFERENCES 169(12):5429-5433. [1] Yang XP, Boehm JS, Yang XP, et al. A public [14] Horvath P, Romero DA, Coute-Monvoisin AC, et al lentiviral expression library of human Diversity, activity, and evolution of CriSPR loci in ORFs. Nat meth,2011,8(8):659661 Streptococcus thermophilus. J Bacteriol, 2008, 190(4) [2 Rana TM. Illuminating the silence: understanding the 1401-1412 structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell [15] Horvath P, Coute-Monvoisin AC, Romero DA, et al Biol,2007,8(1):23-36 Comparative analysis of CRISPR loci in lactic acid http://jourmals.im.ac.cn/cjben
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http://journals.im.ac.cn/cjbcn 470 4 结语 CRISPR-Cas9 技术作为近年来热门的基因编 辑技术，凭借其精准、简便、高效的特点受到众 多研究者的关注，短短几年间已成为基因编辑领 域中最热门的技术，被广泛应用于生物、医学等 领域。基于 CRISPR-Cas9 的高通量功能性筛选技 术也逐渐取代了 RNAi 和 cDNA 文库，为功能基 因的研究提供了高通量高效率的筛选工具。尽管 与传统的筛选方法相比，CRISPR-Cas9 更加高效 可靠且特异性更高，但其仍然存在一些问题，其 中最令人关注的就是脱靶效率。CRISPR-Cas9 系 统依据 20 nt 的 sgRNA 定位靶基因，因此有可能 由于错配而出现脱靶问题。除了设计特异性更高 的 sgRNA 外，研究者们提供了其他的降低脱靶效 率的策略。例如可以使用只切开 DNA 双链一侧 的 Cas9n 切口酶[50]，需要一对 sgRNA 才能完成 DNA 双链剪切，因此可以降低脱靶效率。Vidigal 等[51]则是将 20 nt 的 sgRNA 缩短为 17 nt，剪切效 率不变而脱靶效率降低。另一种策略是将 dCas9 与 FokⅠ核酸酶融合表达来提高筛选特异性[52]。 这些方法虽然能够降低脱靶效率，但是还需要进 一步改进才能应用于高通量的功能性基因筛选。 基于 CRISPR-Cas9 功能性基因筛选技术已经 在细胞生存必需基因鉴定、药物或毒素抗性基因 筛选、潜在治疗靶标筛选、肿瘤转移等相关基因 筛选方面取得了重要进展，为开发有效的靶点特 异性治疗药物奠定了基础，未来也必然会推动整 个生命科学的快速发展。 REFERENCES [1] Yang XP, Boehm JS, Yang XP, et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth, 2011, 8(8): 659–661. [2] Rana TM. Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(1): 23–36. [3] Mohr SE, Smith JA, Shamu CE, et al. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(9): 591–600. [4] Sachse C, Krausz E, Krönke A, et al. High-throughput RNA interference strategies for target discovery and validation by using synthetic short interfering RNAs: functional genomics investigations of biological pathways. Methods Enzymol, 2005, 392: 242–277. [5] Qiu SB, Adema CM, Lane T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Res, 2005, 33(6): 1834–1847. [6] Gratz SJ, Wildonger J, Harrison MM, et al. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering and the promise of designer flies on demand. Fly (Austin), 2013, 7(4): 249–255. [7] Jinek M, East A, Cheng A, et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife, 2013, 2: e00471. [8] Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development, 2013, 140(24): 4982–4987. [9] Shan QW, Wang YP, Li J, et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 686–688. [10] Fujii W, Onuma A, Sugiura K, et al. Efficient generation of genome-modified mice via offset-nicking by CRISPR/Cas system. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 445(4): 791–794. [11] Shalem O, Sanjana NE, Zhang F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nat Rev Genet, 2015, 16(5): 299–311. [12] Wei CX, Liu JY, Yu ZS, et al. TALEN or Cas9-rapid, efficient and specific choices for genome modifications. J Genet Genomics, 2013, 40(6): 281–289. [13] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol, 1987, 169(12): 5429–5433. [14] Horvath P, Romero DA, Coûté-Monvoisin AC, et al. Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. J Bacteriol, 2008, 190(4): 1401–1412. [15] Horvath P, Coûté-Monvoisin AC, Romero DA, et al. Comparative analysis of CRISPR loci in lactic acid