《生物工程学报》：中国“合成生物学”973 项目研究进展（清华大学生命科学学院：陈国强、王颖）.pdf_大学文库

生物工程学报陈国强等中国“合成生物学”973项目研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http:/ljournals.im.ac.cn/cjbcn June25,2015,31(6):995-1008 DO:10.13345/cjb140651 @2015 Chin J Biotech, All rights reserved 热点专题综述陈国强清华大学教授。《生物工程学报》第三、四届副主编。长期从事“微生物和生物材料”的研究,获得相关授权专利25项和39个公开专利。开发的技术已经在数家公司用于大规模生产微生物塑料聚羟基脂肪酸酯PHA。目前是 973“合成生物学”项目的首席科学家。曾连续6年获得清华大学学生“良师益友” 的光荣称号。在国际学术期刊上共发表微生物技术和生物材料相关论文200多篇,论文在 Web of sciences上被引用8000多次(H指数为47) 中国“合成生物学”973项目研究进展陈国强,王颖清华大学生命科学学院,北京100084 陈国强,王颖.中国“合成生物学973项目研究进展.生物工程学报,2015,31(6):995-1008 Chen GQ, Wang Y. Progress in synthetic biology of973 Funding Programin China. Chin J Biotech, 2015, 31(6): 995-1008 摘要:本文回顾了自2011年我国启动“合成生物学”973项目以来所取得的进展。到2014年底为止,我国共启动了9个“合成生物学”973项目,主要集中在微生物制造,加上最近启动的一个动物和一个植物的合成生物学项目,体现了我囯以制造业为主,并向复杂的动物和植物逐渐推进的囯家战略关键词:973项目,合成生物学,微生物制造,工业生物技术 Received: December 31, 2014; Accepted: January 26, 2015 Supported by: National Basic Research Program of China(973 Program)(No. 2012CB725200) Correspondingauthor:GuoqiangChen.Tel:+86-10-62783844;Fax:+86-10-62794217E-mail:cheng@mail.tsinghua.edu.cn 国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2012CB725200)资助网络出版时间:2015-0403 网络出版地址:htp/www.cnkinet/kcms/detail/.1998Q.20150403.100900html

陈国强等/中国“合成生物学”973 项目研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http://journals.im.ac.cn/cjbcn June 25, 2015, 31(6): 995−1008 DOI: 10.13345/j.cjb.140651 ©2015 Chin J Biotech, All rights reserved Received: December 31, 2014; Accepted: January 26, 2015 Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB725200). Corresponding author: Guoqiang Chen. Tel: +86-10-62783844; Fax: +86-10-62794217; E-mail: chengq@mail.tsinghua.edu.cn 国家重点基础研究发展计划 (973 计划) (No. 2012CB725200) 资助。网络出版时间：2015-04-03 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150403.1009.002.html 生物工程学报 995 陈国强清华大学教授。《生物工程学报》第三、四届副主编。长期从事“微生物和生物材料”的研究，获得相关授权专利 25 项和 39 个公开专利。开发的技术已经在数家公司用于大规模生产微生物塑料聚羟基脂肪酸酯 PHA。目前是 973“合成生物学”项目的首席科学家。曾连续 6 年获得清华大学学生“良师益友” 的光荣称号。在国际学术期刊上共发表微生物技术和生物材料相关论文 200 多篇，论文在 Web of Sciences 上被引用 8 000 多次 (H 指数为 47)。中国“合成生物学”973 项目研究进展陈国强，王颖清华大学生命科学学院，北京 100084 陈国强, 王颖. 中国“合成生物学”973 项目研究进展. 生物工程学报, 2015, 31(6): 995–1008. Chen GQ, Wang Y. Progress in synthetic biology of “973 Funding Program” in China. Chin J Biotech, 2015, 31(6): 995–1008. 摘要: 本文回顾了自 2011 年我国启动“合成生物学”973 项目以来所取得的进展。到 2014 年底为止，我国共启动了 9 个“合成生物学”973 项目，主要集中在微生物制造，加上最近启动的一个动物和一个植物的合成生物学项目，体现了我国以制造业为主，并向复杂的动物和植物逐渐推进的国家战略。关键词: 973 项目，合成生物学，微生物制造，工业生物技术热点专题综述

996 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2015 VoL31 No6 Progress in synthetic biology of973 Funding Program"in China Guoqiang Chen, and Ying wang School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China Abstract: This paper reviews progresses made in China from 2011 in areas of"Synthetic Biology" supported by State Basic Research 973 Program. Till the end of 2014, 9"synthetic biology" projects have been initiated with emphasis on microbial manufactures" with the 973 Funding Program. Combined with the very recent launch of one project or mammalian cell synthetic biology" and another on"plant synthetic biology", Chinese"synthetic biology"research reflects its focus on"manufactures"while not giving up efforts on"synthetic biology" of complex systems Keywords: 973 Program, synthetic biology, bio-manufacture, industrial biotechnology 合成生物学”这门工程和科学结合的新学10项和863项目一项。我国主要支持了与制造科在近年来得到各国的关注和大量的投资。带业“工业生物技术”相关的“合成生物学”研究着未来对重塑生命和改造生命的憧憬,各个学项,主要以容易改造的微生物为研究对象。同科包括生命、工程、计算机甚至机械制造等,时,也开始支持了一项以哺乳细胞为对象的合都投入了设计生命和合成生命的研究行列中成生物学,以及一项植物的“合成生物学”。下面对合成生物学是指按照一定的规律和已有的上述科技部支持的项目的研究进展进行回顾识,一方面设计和建造新的生物零件、装置和系统:;另一方面重新设计已有的天然生物系1“人工合成细胞工厂”研究的主要进展统为人类的特殊目的服务。简单地说,合成生物以中国科学院天津工业生物技术研究所马学就是通过人工设计和构建自然界中不存在的延和为首席的“人工合成细胞工厂”973项目,以生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问人工合成生物体的工业应用为目标,集中硏究题。合成生物学强调“设计”和“重设计”。设计、解决底盘细胞与化学品合成途径设计与构建等模拟、实验是合成生物学的基础。合成生物学方面的关键科学问题,围绕大肠杆菌和光合蓝不仅仅是实验,利用已有的生物学知识,根据细菌两类代表性的底盘细胞构建,以及从CO 实际的需要进行设计和重设计,建立数学模型与葡萄糖到化学品两类合成途径的创建,构建对人工的设计进行模拟从而指导实验的进行也人工合成细胞工厂(图1)。项目立项近4年来, 是合成生物学的方法。合成生物学的核心问题在底盘细胞构建、化学品合成的元件设计合成之一是“新生命的合成”。通过新生命的合成扩大合成途径创建及合成细胞工厂构建,以及合成生命的能力,更好地为人类服务生物学基本技术开发方面取得了一系列重要进我国是制造业大国,所以,自2011年科技展。进一步发展和完善了基于芯片的基因合成部开始对“合成生物学”进行支持,包括973项目技术,采用错配特异性内切酶和结合蛋白 httpjournals

ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2015 Vol.31 No.6 http://journals.im.ac.cn/cjbcn 996 Progress in synthetic biology of “973 Funding Program” in China Guoqiang Chen, and Ying Wang School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China Abstract: This paper reviews progresses made in China from 2011 in areas of “Synthetic Biology” supported by State Basic Research 973 Program. Till the end of 2014, 9 “synthetic biology” projects have been initiated with emphasis on “microbial manufactures” with the 973 Funding Program. Combined with the very recent launch of one project on “mammalian cell synthetic biology” and another on “plant synthetic biology”, Chinese “synthetic biology” research reflects its focus on “manufactures” while not giving up efforts on “synthetic biology” of complex systems. Keywords: 973 Program, synthetic biology, bio-manufacture, industrial biotechnology “合成生物学”这门工程和科学结合的新学科在近年来得到各国的关注和大量的投资。带着未来对重塑生命和改造生命的憧憬，各个学科包括生命、工程、计算机甚至机械制造等，都投入了设计生命和合成生命的研究行列中。合成生物学是指按照一定的规律和已有的知识，一方面设计和建造新的生物零件、装置和系统；另一方面重新设计已有的天然生物系统为人类的特殊目的服务。简单地说, 合成生物学就是通过人工设计和构建自然界中不存在的生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题。合成生物学强调“设计”和“重设计”。设计、模拟、实验是合成生物学的基础。合成生物学不仅仅是实验，利用已有的生物学知识，根据实际的需要进行设计和重设计，建立数学模型对人工的设计进行模拟从而指导实验的进行也是合成生物学的方法。合成生物学的核心问题之一是“新生命的合成”。通过新生命的合成扩大生命的能力，更好地为人类服务。我国是制造业大国，所以，自 2011 年科技部开始对“合成生物学”进行支持，包括 973 项目 10 项和 863 项目一项。我国主要支持了与制造业“工业生物技术”相关的“合成生物学”研究 7 项，主要以容易改造的微生物为研究对象。同时，也开始支持了一项以哺乳细胞为对象的合成生物学，以及一项植物的“合成生物学”。下面对上述科技部支持的项目的研究进展进行回顾。 1 “人工合成细胞工厂”研究的主要进展以中国科学院天津工业生物技术研究所马延和为首席的“人工合成细胞工厂”973 项目，以人工合成生物体的工业应用为目标，集中研究解决底盘细胞与化学品合成途径设计与构建等方面的关键科学问题，围绕大肠杆菌和光合蓝细菌两类代表性的底盘细胞构建，以及从 CO2 与葡萄糖到化学品两类合成途径的创建，构建人工合成细胞工厂 (图 1)。项目立项近 4 年来，在底盘细胞构建、化学品合成的元件设计合成、合成途径创建及合成细胞工厂构建，以及合成生物学基本技术开发方面取得了一系列重要进展。进一步发展和完善了基于芯片的基因合成技术，采用错配特异性内切酶和结合蛋白

陈国强等冲中国“合成生物学”973项目研究进展 Escherichia with reduced ·· From sugar to polymer otOSY ceri · From co2 to petroleum chassis with small genome Synthetic pathway for production commodity chemicals 图1人工合成细胞工厂973项目框架 Fig. I Framework of 973 project on artificial cell factories. The project consists of constructions of E. coli chassis with simplified chromosome, phototrophic chassis cells with reduced chromosomes, and novel bulk chemicals biosynthesis pathways. The project should allow productions of bulk materials and chemicals from sugars or CO Muts降低寡核苷酸及组装的DNA的错误率, 比国际水平高5倍,丁二酸产量达到125g/L 将芯片合成的寡核苷酸错误率从1/500bp降低产物对底物葡萄糖的转化率为105%(可部分固到1/8700bp。同时实现了基因的原位扩增和组定CO2),技术指标处于国际领先水平。在对装,突破了目前需要先合成短片段DNA再拼接光合蓝细菌底盘细胞的生理调控机制进行系统的传统DNA合成模式,大大降低了成本水平。研究和形成较为完整的理解和认识的基础上针对认识生命本质、突破细胞进化限制、实现构建了一系列获得抗逆性能提高的光合蓝细菌人工生命体构建的需要,通过大肠杆菌基因组底盘细胞,通过光合模块、CO2固定和生物合必需基因的分析,重构了模块化、成簇化“必需成模块的重构和优化,实现了从CO2生物合成基因功能群”;在建立途径模拟计算设计技术的酮、醇和酸等典型化学品,为发展和利用新的生长10%,加快葡萄糖消耗速度达20%,为“糖基丁酸均为国际上首次报道6乳酸和3羟基础上凹,设计合成人工糖酵解途径,增加细胞碳资源提供了可能,其中丙酮酵解高速公路”构建奠定基础。建立了新的蛋白 2“新功能人造生物器件的构建及集成” 质设计方法,可成功实现给定目标结构的蛋白全序列从头设计,基于化学反应特征和胞内调研究的主要进展控位点,计算设计与合成表征了满足30种重要以中国科学院上海生命科学院赵国屏为首化学品生物合成的功能元件,形成了约1200个席的973项目围绕新功能人造生物器件的设计功能特性清晰的元件库,为化学品合成途径和原理、合成组装、模块构建、标准化建库及在高效人工合成细胞工厂创建奠定了物质基础功能底盘细胞中集成与适配机制等关键科学问题和元件。利用DNA组装和精确表达调控技术,相关技术难点,以萜类化合物的人工异源合成创建和优化了从葡萄糖到丁二酸、戊二胺、己为主要研究对象,取得了若干重要进展。尤其二酸和5-氨基乙酰丙酸等途径,达到预期原子是在稀有人参皂苷CK(图2)、甜菊糖苷和丹经济性,其中5-氨基乙酰丙酸产量达到50g,参酮前体铁锈醇等重要药用食用萜类化合物

陈国强等/中国“合成生物学”973 项目研究进展 cjb@im.ac.cn 997 图 1 人工合成细胞工厂 973 项目框架 Fig. 1 Framework of 973 project on artificial cell factories. The project consists of constructions of E. coli chassis with simplified chromosome, phototrophic chassis cells with reduced chromosomes, and novel bulk chemicals biosynthesis pathways. The project should allow productions of bulk materials and chemicals from sugars or CO2. Muts 降低寡核苷酸及组装的 DNA 的错误率，将芯片合成的寡核苷酸错误率从 1/500 bp 降低到 1/8 700 bp。同时实现了基因的原位扩增和组装，突破了目前需要先合成短片段 DNA 再拼接的传统 DNA 合成模式，大大降低了成本水平[1]。针对认识生命本质、突破细胞进化限制、实现人工生命体构建的需要，通过大肠杆菌基因组必需基因的分析，重构了模块化、成簇化“必需基因功能群”；在建立途径模拟计算设计技术的基础上[2]，设计合成人工糖酵解途径，增加细胞生长 10%，加快葡萄糖消耗速度达 20%，为“糖酵解高速公路”构建奠定基础。建立了新的蛋白质设计方法，可成功实现给定目标结构的蛋白全序列从头设计[3]，基于化学反应特征和胞内调控位点，计算设计与合成表征了满足 30 种重要化学品生物合成的功能元件，形成了约 1 200 个功能特性清晰的元件库，为化学品合成途径和高效人工合成细胞工厂创建奠定了物质基础功能元件[4]。利用 DNA 组装和精确表达调控技术[5]，创建和优化了从葡萄糖到丁二酸、戊二胺、己二酸和 5-氨基乙酰丙酸等途径，达到预期原子经济性，其中 5-氨基乙酰丙酸产量达到 50 g/L，比国际水平高 5 倍，丁二酸产量达到 125 g/L，产物对底物葡萄糖的转化率为 105% (可部分固定 CO2) [6]，技术指标处于国际领先水平。在对光合蓝细菌底盘细胞的生理调控机制进行系统研究和形成较为完整的理解和认识的基础上，构建了一系列获得抗逆性能提高的光合蓝细菌底盘细胞[7]，通过光合模块、CO2 固定和生物合成模块的重构和优化，实现了从 CO2 生物合成酮、醇和酸等典型化学品，为发展和利用新的碳资源提供了可能，其中丙酮、D-乳酸和 3-羟基丁酸均为国际上首次报道[8-9]。 2 “新功能人造生物器件的构建及集成” 研究的主要进展以中国科学院上海生命科学院赵国屏为首席的 973 项目围绕新功能人造生物器件的设计原理、合成组装、模块构建、标准化建库及在底盘细胞中集成与适配机制等关键科学问题和相关技术难点，以萜类化合物的人工异源合成为主要研究对象，取得了若干重要进展。尤其是在稀有人参皂苷 CK[10] (图 2)、甜菊糖苷和丹参酮前体铁锈醇[11]等重要药用食用萜类化合物

陈国强等冲中国“合成生物学”973项目研究进展略,组装二萜前体合成、次丹参酮二烯合成和略缺少相应途径的稳态动力学参数,以及对所细胞色素P450氧化的模块(CYP76AH1),优化研究代谢途径的认识不够充分,很难去建立模块内部各元件间的适配性,构建了次丹参酮个通用、高效的系统,这也影响了构建人工合二烯和铁锈醇人工合成细胞工厂,产量分别达到成生物体系的效率。应用“定向代谢工程”技术 360mg/L和40mg/L,对丹参酮及其他植物源萜即基于催化体系体外重建的合成途径快速优化类化合物的微生物制造具有重要参考价值的体系,通过系统的稳态动力学分析,快速获取了所研究代谢途径中各个组分的贡献,进而 3“徽生物药物创新与优产的人工合成指导体内定向改造工作(图4,应用这套体系体系”研究的主要进展对多种微生物药物的关键合成途径中的限速步上海交通大学的冯雁作为973项目的首席骤进行了确定,在短时间内即极大提高了萜类化合物法尼烯、番茄红素、胡萝卜素和虾青科学家,通过工程化的系统设计、用标准化和素等产量,体现了该方法的广阔应用潜力,其模块化的元素来构建人工合成生物体系,高效地建立和完善微生物药物创新和优产的新模中番茄红素已经通过150L中试发酵放大,发酵时间相比传统的霉菌发酵缩短为原来的1/5,目式、推动微生物药物产业的跨越式提升和发展前正在进行进一步工业放大测试;而且这种方武汉大学胡黔楠研究组构建了逆向设计微法可以拓展到聚酮类药物的优化和高产中,为生物药物合成的平台。他们重组了具有化学转化意义和基于代谢途径的基因组规模代谢网网梨酮合酶元件的适配机制的确定和元件的比例优化和筛选提供平台19 络,从40000多篇生物合成文献中有效整合了超过30000多条的生物合成反应数据,实现了生物合成反应关键反应模式提取的技术 Microbial cell factory design platfo rxnpatter;开发了基于生物合成反应结构的催化 Biosynthetic data Developi Discovery- 该反应类型的生物合成酶的在线预测服务器 RxnFinder ECAssigner RxnPatter ECAssigner;构建了“生物合成反应数据库—生物 reaction search enzyme discovery biosynthesis rule 合成转换规律——生物合成途径设计—生物合 Cell factory design 成实验验证”的技术体系Rxnp131(图3)。该数 E coli 3D BioSynther 据库受到国际上的广泛关注,被 Elsevier公司的 reaction network reaction data biosynthesis design Sciverse收录。该工具不仅可用于微生物药物的合成,并且在平台化学品、生物材料等化合物图3微生物药物生物合成的逆向途径设计平台的人工合成体系构建中也具有重要的应用 microbial pharmaceutics. It involves extraction of 潜力。 bioinformatics from antibiotics producing Streptomycetes, 催化元件的系统匹配与优化是实现人工代 evelopments of models for biosynthesis and transformation, reverse design of biosynthesis pathways 谢途径高效运行的基础。由于传统代谢工程策 from secondary metabolic products et al

陈国强等/中国“合成生物学”973 项目研究进展 cjb@im.ac.cn 999 略，组装二萜前体合成、次丹参酮二烯合成和细胞色素 P450 氧化的模块 (CYP76AH1)，优化模块内部各元件间的适配性，构建了次丹参酮二烯和铁锈醇人工合成细胞工厂，产量分别达到 360 mg/L 和 40 mg/L，对丹参酮及其他植物源萜类化合物的微生物制造具有重要参考价值。 3 “微生物药物创新与优产的人工合成体系”研究的主要进展上海交通大学的冯雁作为 973 项目的首席科学家，通过工程化的系统设计、用标准化和模块化的元素来构建人工合成生物体系，高效地建立和完善微生物药物创新和优产的新模式、推动微生物药物产业的跨越式提升和发展。武汉大学胡黔楠研究组构建了逆向设计微生物药物合成的平台。他们重组了具有化学转化意义和基于代谢途径的基因组规模代谢网络，从 40 000 多篇生物合成文献中有效整合了超过 30 000 多条的生物合成反应数据，实现了生物合成反应关键反应模式提取的技术 rxnpatter；开发了基于生物合成反应结构的催化该反应类型的生物合成酶的在线预测服务器 ECAssigner；构建了“生物合成反应数据库——生物合成转换规律——生物合成途径设计——生物合成实验验证”的技术体系 Rxnip[15-17] (图 3)。该数据库受到国际上的广泛关注，被 Elsevier 公司的 SciVerse 收录。该工具不仅可用于微生物药物的合成，并且在平台化学品、生物材料等化合物的人工合成体系构建中也具有重要的应用潜力。催化元件的系统匹配与优化是实现人工代谢途径高效运行的基础。由于传统代谢工程策略缺少相应途径的稳态动力学参数，以及对所研究代谢途径的认识不够充分，很难去建立一个通用、高效的系统，这也影响了构建人工合成生物体系的效率。应用“定向代谢工程”技术，即基于催化体系体外重建的合成途径快速优化的体系，通过系统的稳态动力学分析，快速获取了所研究代谢途径中各个组分的贡献，进而指导体内定向改造工作 (图 4)。应用这套体系对多种微生物药物的关键合成途径中的限速步骤进行了确定，在短时间内即极大提高了萜类化合物法尼烯[18]、番茄红素、胡萝卜素和虾青素等产量，体现了该方法的广阔应用潜力，其中番茄红素已经通过 150 L 中试发酵放大，发酵时间相比传统的霉菌发酵缩短为原来的 1/5，目前正在进行进一步工业放大测试；而且这种方法可以拓展到聚酮类药物的优化和高产中，为聚酮合酶元件的适配机制的确定和元件的比例优化和筛选提供平台[19]。图 3 微生物药物生物合成的逆向途径设计平台 Fig. 3 Reverse biosynthesis pathway design platform for microbial pharmaceutics. It involves extraction of bioinformatics from antibiotics producing Streptomycetes, developments of models for biosynthesis and transformation, reverse design of biosynthesis pathways from secondary metabolic products et al

1000 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2015Vol31 No6 In vitro reconstruction Rapid MVa pathway proteins Rate-limiting step 4000 Guide to targeted engineering in vivo 3200 1.1gL 1600· 200 . Signicantly increased t(h 图4甲羟戊酸途径的体外重建与法尼烯的高效生产 Fig 4 In vitro pathway reconstructions of mevalonate and high efficient production of farnesene 4“用合成生物学方法构建生物基材料了嗜盐微生物的合成生物学研究体系。该体系的合成新途径研究的主要进展通过合成生物学手段,构建了制造各种化学品的平台24,包括5-氨基乙酰丙酸、维生素B12 清华大学陈国强为首席的973项目采用化和3羟基丙酸等。该嗜盐细菌生物制造平台具学与生物结合的方法设计、合成和组装各种生有如下特点,克服了一般生物制造的缺点,使物基材料聚羟基脂肪酸酯PHA的合成路径,通生物制造成本能大幅降低,包括:1)节能:发过合成生物学双稳态调控的方法改变了微生物酵过程无需高温高压灭菌:2)节水:可以用海的生长模式,并获得了有复合功能的微生物合水替代淡水,而且过程产生的水可以多次循环成体系,实现细菌基因组减少10%的目标,使微利用:3)连续发酵制造:由于染菌几率减少了, 生物达到生长快速、体积大、生物基材料结构生产过程可以连续起来:4)过程操作简单:由丰富的新特点。他们通过网络优化、最小基于无需灭菌和可连续的发酵,简化了操作过程因组等设计了至少3条新的多基因合成路径,5)设备投资大幅度减少:由于无需发酵过程无并验证了其正确性。获得至少两个新的生物基需高温高压灭菌,就不需要使用昂贵的不锈钢材料μ在更大规模(发酵罐上)实现了微生物发酵罐和不锈钢管道系统,转而使用便宜的塑生长状态的变化,使下游处理简单化凹2。此外,料、陶瓷甚至水泥罐体或管道等;6)不与人争他们建立了嗜盐单胞菌的遗传操作平台,并开粮:筛选的嗜盐细菌可以利用淀粉、蛋白、脂发了其在人工模拟海水中、利用成分近似餐厨肪、甚至纤维素和脂肪酸等生长,这些都是食垃圾的混合底物实现连续无灭菌发酵的发酵工物的组成。用餐厨废料也能使嗜盐细菌生长, 艺,降低了生产成本23。目前该项目已经建立制造我们所需的产品:7)产物最终浓度大幅度 tp: //joumals. im ac cn/cjbcn

ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2015 Vol.31 No.6 http://journals.im.ac.cn/cjbcn 1000 图 4 甲羟戊酸途径的体外重建与法尼烯的高效生产 Fig. 4 In vitro pathway reconstructions of mevalonate and high efficient production of farnesene. 4 “用合成生物学方法构建生物基材料的合成新途径”研究的主要进展清华大学陈国强为首席的 973 项目采用化学与生物结合的方法设计、合成和组装各种生物基材料聚羟基脂肪酸酯 PHA 的合成路径，通过合成生物学双稳态调控的方法改变了微生物的生长模式，并获得了有复合功能的微生物合成体系，实现细菌基因组减少 10%的目标，使微生物达到生长快速、体积大、生物基材料结构丰富的新特点[20]。他们通过网络优化、最小基因组等设计了至少 3 条新的多基因合成路径，并验证了其正确性。获得至少两个新的生物基材料[21]。在更大规模 (发酵罐上) 实现了微生物生长状态的变化，使下游处理简单化[22]。此外，他们建立了嗜盐单胞菌的遗传操作平台，并开发了其在人工模拟海水中、利用成分近似餐厨垃圾的混合底物实现连续无灭菌发酵的发酵工艺，降低了生产成本[23]。目前该项目已经建立了嗜盐微生物的合成生物学研究体系。该体系通过合成生物学手段，构建了制造各种化学品的平台[24]，包括 5-氨基乙酰丙酸、维生素 B12 和 3-羟基丙酸等。该嗜盐细菌生物制造平台具有如下特点，克服了一般生物制造的缺点，使生物制造成本能大幅降低，包括：1) 节能：发酵过程无需高温高压灭菌；2) 节水：可以用海水替代淡水，而且过程产生的水可以多次循环利用；3) 连续发酵制造：由于染菌几率减少了，生产过程可以连续起来；4) 过程操作简单：由于无需灭菌和可连续的发酵，简化了操作过程； 5) 设备投资大幅度减少：由于无需发酵过程无需高温高压灭菌，就不需要使用昂贵的不锈钢发酵罐和不锈钢管道系统，转而使用便宜的塑料、陶瓷甚至水泥罐体或管道等；6) 不与人争粮：筛选的嗜盐细菌可以利用淀粉、蛋白、脂肪、甚至纤维素和脂肪酸等生长，这些都是食物的组成。用餐厨废料也能使嗜盐细菌生长，制造我们所需的产品；7) 产物最终浓度大幅度

1002 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2015Vol31 No6 5“抗逆元器件的构建和机理研究”研6“合成微生物体系的适配性研究”研究究的主要进展的主要进展由清华大学林章凛主持的973项目研究适以中国科学院微生物研究所张立新为首席的配微生物和植物的合成生物学抗逆元器件(即973项目,选择了微生物药物阿维菌素和 polynia 元件与模块),及其在工业和农业上的应用,以为研究对象,开展基于生物底盘调控特性的生期提升我国庞大生物制造业的节能减排,如物元件表征和设计,解决底盘代谢网络与其加 200亿元年产值的发酵产业菌种的抗酸和抗高载的外源生物元件的兼容性问题,突出人工合温需求;并储备高效抗逆农业的战略技术,尤成的调控元件对结构基因定时、定量表达的决定其是670多hm2%以及以下盐碱地的利用。由性作用。以聚酮类药物和核苷肽类药物的合于产业和资源特点的不同,欧美国家尚未特别成途径作为代表性案例,在已建立的技术平台关注抗逆元器件研究,因此这也是我国参与国上高通量地分析和解决不同元件之间的适配性际合成生物学研究竞争的独特机遇。前两年项问题,构建大肠杆菌和链霉菌中的适配性研究围绕如下两个关键科学问题开展工作(表1):1) 抗逆元器件构建的分子设计原理;2)抗逆元器体系。同时,对异源模块与生物底盘之间交互件在底盘生物的作用机理。建立了有特色的抗式作用的计算与预测、适配性研究与系统优化, 逆元件库、形成了抗逆器件设计和实验室评估深化对生物功能器件反应特性及加载生物元件能力:提出了利用极端微生物调控基因的重要的底盘代谢网络的认识,借鉴工程学原理在非科学思想2:发展了一个系统的商用微生物抗生命系统中应用的成功经验,同时考虑生命系酸器件逐级评估技术(从实验室到发酵工厂统的特殊性,实现对合成生物系统的各调控单并在有重要产业应用价值的微生物抗酸器件和元模块化、标准化,并最终在合成微生物体系植物抗盐碱器件上取得重要突破,分别通过工中进行系统集成,揭示具有非天然新功能的生业菌株工厂发酵的验证和田间试验的验证,大物元件、器件、模块,以及更高层次的合成生幅度地提前完成了相关实施效果的目标。物系统构建过程的新原理和新途径(图6) 表1抗逆元器件的构建和机理研究创新点 Table 1 Construction of stress resistance biobricks and the novelties of the mechanism stud One thought Salt and alkali resistant Rapeseed Highest resistant levels both in the labs and use of regulatory components new species (350 mmol/L) field in the field trials reported (200 mmoL/L=1/3 trial(200 mmol/L) One evaluation technique: pH reduced one unit for industrial No yet reported in industrial strains Mid-term develop an acid resistant part strain Ajinomoto is working in the lab at neutral for systematic evaluation pH. We also develop RNA par establishin and acid, some parts are unique(GadBC global regulatory proteins IrrE, CFPS) tp: //joumals. im ac cn/cjbcn

ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2015 Vol.31 No.6 http://journals.im.ac.cn/cjbcn 1002 5 “抗逆元器件的构建和机理研究” 研究的主要进展由清华大学林章凛主持的 973 项目研究适配微生物和植物的合成生物学抗逆元器件 (即元件与模块)，及其在工业和农业上的应用，以期提升我国庞大生物制造业的节能减排，如 2 000 亿元年产值的发酵产业菌种的抗酸和抗高温需求；并储备高效抗逆农业的战略技术，尤其是 670 多 hm2 2%以及以下盐碱地的利用。由于产业和资源特点的不同，欧美国家尚未特别关注抗逆元器件研究，因此这也是我国参与国际合成生物学研究竞争的独特机遇。前两年项目围绕如下两个关键科学问题开展工作 (表 1)：1) 抗逆元器件构建的分子设计原理；2) 抗逆元器件在底盘生物的作用机理。建立了有特色的抗逆元件库、形成了抗逆器件设计和实验室评估能力；提出了利用极端微生物调控基因的重要科学思想[25]；发展了一个系统的商用微生物抗酸器件逐级评估技术 (从实验室到发酵工厂)，并在有重要产业应用价值的微生物抗酸器件和植物抗盐碱器件上取得重要突破，分别通过工业菌株工厂发酵的验证和田间试验的验证，大幅度地提前完成了相关实施效果的目标。 6 “合成微生物体系的适配性研究”研究的主要进展以中国科学院微生物研究所张立新为首席的 973 项目，选择了微生物药物阿维菌素和 polynikA 为研究对象，开展基于生物底盘调控特性的生物元件表征和设计，解决底盘代谢网络与其加载的外源生物元件的兼容性问题，突出人工合成的调控元件对结构基因定时、定量表达的决定性作用[26]。以聚酮类药物和核苷肽类药物的合成途径作为代表性案例，在已建立的技术平台上高通量地分析和解决不同元件之间的适配性问题，构建大肠杆菌和链霉菌中的适配性研究体系。同时，对异源模块与生物底盘之间交互式作用的计算与预测、适配性研究与系统优化，深化对生物功能器件反应特性及加载生物元件的底盘代谢网络的认识，借鉴工程学原理在非生命系统中应用的成功经验，同时考虑生命系统的特殊性，实现对合成生物系统的各调控单元模块化、标准化，并最终在合成微生物体系中进行系统集成，揭示具有非天然新功能的生物元件、器件、模块，以及更高层次的合成生物系统构建过程的新原理和新途径[27] (图 6)。表 1 抗逆元器件的构建和机理研究创新点 Table 1 Construction of stress resistance biobricks and the novelties of the mechanism study Mid-term Novelty Goals Innovations One thought: use of regulatory components from extremophiles Salt and alkali resistant Rapeseed new species (350 mmol/L); field trial (200 mmol/L) Highest resistant levels both in the labs and in the field trials reported (200 mmol/L = 1/3 seawater concentration) One evaluation technique: develop an acid resistant part for systematic evaluation pH reduced one unit for industrial strain No yet reported in industrial strains Ajinomoto is working in the lab at neutral pH. We also develop RNA parts A resistant part library: establishing Develop a library of regulatory parts for enhanced resistances Systematic collection and characterizations of parts resistances against salt, alkali, dry and acid, some parts are unique (GadBC, global regulatory proteins IrrE, CFPS)

陈国强等冲中国“合成生物学”973项目研究进展 Customized structural and regulatory parts for the chassis Reiterate Test] ( Project 1) eedback Optimize compatibility between heterologous modulesFeedback and chassis, and between parts and modules optimize Balance metabolic flux 图6“合成微生物体系的适配性研究”各课题相互之间的关系及课题与所需解决科学问题 Fig. 6 Relationship among tasks and scientific problems to be solved by project ofComaptibility study of synthetic microorganism systems", including project I regulatory and structural parts based on chassis property project 2 modules of chassis metabolic network and prediction on functions of parts; project 3 optimized compatibility of hetereogeous modules to chassis and optimization of modular compatibility; project 4 assembly of synthetic microorganism system 本项目全面解析了模式链霉菌基因转录时谢途径进行改造:对大肠杆菌底盘细胞中与序30,得到了组成型和时序型启动子库,并 polynia及阿维菌素前体合成的代谢途径进行改造获得了目前链霉菌中最强的启动子;建立改造:设计强化 NADPH等辅助因子的循环回补基于流式细胞仪的链霉菌单细胞启动子表征平调控通路,保证大肠杆菌底盘细胞中的能量、台;在链霉菌中建立3套新型诱导表达系统;辅助因子、还原力的平衡,保证合成途径的有利用合成生物学遗传电路原理,建立新的抑制效进行:对底盘细胞中与聚酮类药物合成竞争蛋白筛选方法;解析了抗生素介导的新调控机的脂肪酸合成途径进行改造;为大肠杆菌简约制,为适配性设计提供了思路和解决方案。同全基因组代谢网络模型提供实验数据。此外, 时,针对目标产物,首次考察了生物合成途径在大肠杆菌底盘中建立初级代谢途径的检测手中基于自由能变化的原子经济性,构建了加载段,建立聚酮类药物、核苷肽类药物前体的高外源生物模块的大肠杆菌和链霉菌底盘代谢网通量筛选方法。最后,还在链霉菌中开发了一络,并通过将FBA和MOMA结合来预测底盘种可精确设计和预测的模块化微调转录和翻译细胞加载外源生物模块后的适配性,指导对链过程适配性的新方法,系统集成和自由拆分阿霉菌底盘中的前体供应、还原力、产物转运体维菌素模块:综合组学分析解析阿维菌素高产系进行了改造,对大肠杆菌底盘细胞中建立糖机制,并进一步设计、合成、获得超高产菌株, 酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环途径代并在工业生产上得到验证

陈国强等/中国“合成生物学”973 项目研究进展 cjb@im.ac.cn 1003 图 6 “合成微生物体系的适配性研究”各课题相互之间的关系及课题与所需解决科学问题 Fig. 6 Relationship among tasks and scientific problems to be solved by project of “Comaptibility study of synthetic microorganism systems”, including project 1 regulatory and structural parts based on chassis property; project 2 modules of chassis metabolic network and prediction on functions of parts; project 3 optimized compatibility of hetereogeous modules to chassis and optimization of modular compatibility; project 4 assembly of synthetic microorganism system. 本项目全面解析了模式链霉菌基因转录时序[28-30]，得到了组成型和时序型启动子库，并改造获得了目前链霉菌中最强的启动子；建立基于流式细胞仪的链霉菌单细胞启动子表征平台；在链霉菌中建立 3 套新型诱导表达系统；利用合成生物学遗传电路原理，建立新的抑制蛋白筛选方法；解析了抗生素介导的新调控机制，为适配性设计提供了思路和解决方案。同时，针对目标产物，首次考察了生物合成途径中基于自由能变化的原子经济性，构建了加载外源生物模块的大肠杆菌和链霉菌底盘代谢网络，并通过将 FBA 和 MOMA 结合来预测底盘细胞加载外源生物模块后的适配性，指导对链霉菌底盘中的前体供应、还原力、产物转运体系进行了改造，对大肠杆菌底盘细胞中建立糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环途径代谢途径进行改造；对大肠杆菌底盘细胞中与 polynikA 及阿维菌素前体合成的代谢途径进行改造；设计强化 NADPH 等辅助因子的循环回补调控通路，保证大肠杆菌底盘细胞中的能量、辅助因子、还原力的平衡，保证合成途径的有效进行；对底盘细胞中与聚酮类药物合成竞争的脂肪酸合成途径进行改造；为大肠杆菌简约全基因组代谢网络模型提供实验数据。此外，在大肠杆菌底盘中建立初级代谢途径的检测手段，建立聚酮类药物、核苷肽类药物前体的高通量筛选方法。最后，还在链霉菌中开发了一种可精确设计和预测的模块化微调转录和翻译过程适配性的新方法，系统集成和自由拆分阿维菌素模块；综合组学分析解析阿维菌素高产机制，并进一步设计、合成、获得超高产菌株，并在工业生产上得到验证