Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 第4章 光子技术在生物医学领域的新发展即应用 4.1 心脏光标测技术 荧光探针、光学系统、光源和探测器的不断完善和发展使 荧光成像技术得到快速发展，并在生物医学领域得到 广泛应用。 光学标测技术是指通过荧光染料对细胞进行标记，然后通过 相应波长的激发光照射样品。样品被激发后，荧光分 子吸收一个光子，从基态跃迁到激发态，经过能量驰 豫后，发射一个长波光子回到基态，依赖这种方式的 就可以成像并进行测量得到所需要的信息。 光学标测技术实现了高分辨率下组织或细胞膜电位、Ca2+浓 度等生理信息的实时检测
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 第4章第1节心脏光标测技术 认识和了解细胞膜电活动为生理学家从微观领域揭示生命现象的奥秘， 探索疾病的发生机制，治疗诸如心脑血管、神经障碍等疾病提供了重 要的依据。 运用细胞内电极记录或膜片钳记录技术,尤其是结合分子生物学的方法, 对心脏细胞膜离子通道的生物物理特性、通道结构与功能的关系等都 有了深入的认识。 但是,单纯凭借这类研究技术,很难了解在细胞间电偶联状态下心脏电活 动的整体行为。因此，传统的手段已无法满足当前研究的需要，基于 电压敏感染料的膜电位光学标测方法自问世以来得到了迅速发展并在 实际研究中发挥着越来越重要的作用。该技术的优势主要体现在：1） 可以多位点同步记录细胞膜电活动，动态显示膜电位的传导过程；2） 具有高的时间和空间分辨率，时间分辨可达几十微秒，空间分辨可达 数微米；3）具有无创性,可有效避免接触型测量中电极对细胞膜的机 械损伤；4）避免外部电磁场干扰，可为心脏电除颤等机理研究提供可 能
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 图4-1光标测机理 光源 光学探测器 激发光 滤光片 发射光 滤光片 细胞 光学方法记录细胞跨膜电位是基于电压敏感性荧光染料的使用。该技术的 基本原理是：将电压敏感染料（Voltage－Sensitive Dyes，VSDs，又称 分子探针）灌注于待观测的细胞或组织，即待测物内（称为染色）。然后， 用激发光（excitation light）照射待测物表面（图4-1），当细胞膜电 位改变时（△Vm），染料自身的荧光特性或吸光特性能够跟随局部电场的 变化而改变，且这种变化与膜电位的改变呈近似线性关系。由于发射光 （emission light）波长远离激发光波长，因此，可利用光学滤光片，如 二向色镜滤除待测物上的激发光后，将发射的荧光信号经探测器接收并利 用等时图、等势图等手段分析、成像
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 电压敏感染料可以感受到局部电场的变化，但是，染料具有 特异性和敏感性，不同研究对象具有不同染色效果。电压 敏感染料又称为分子探针（molecular probe）或光学探针 （optical probe）。它们能够随着局部电场的变化改变染 料自身的荧光特性或吸光特性，且这种变化与电极记录到 的膜电位变化呈线性关系。 目前所发现的电压敏感染料多达2000多种，它们可按照自身 光学特性变化的类型或染料对电场变化响应的速度快慢来 分类。前者分为吸光性、光折射性和荧光特性染料，后者 分为快反应和慢反应染料。在对神经系统、心肌细胞的电 生理研究中多使用快反应染料，其中包括产生荧光变化的 di-8-ANEPPS、di-4-ANEPPS、RH421染料和吸光性变化的染 料RH155等
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 由于电压敏感染料具有特异性和敏感性，对不同的研究对象可能产生不 同的染色效果，因此，实验前要根据所准备的材料进行染料的筛选。 染料的选择和使用应考虑： 1）光强的相对变化率。在记录单细胞微观特性时，被测信号一般都很 小，因此，应尽量选择荧光或吸光强度相对变化率（△F/F或△A/A） 大的染料，以提高记录系统信噪比； 2）染料的内化（internalization）。一部分镶嵌在细胞膜表面的染料 分子会逐渐进入细胞内部造成荧光信号的衰减。研究证实内化过程与 染料的类型有关。烷基链（alkyl chains）长的染料内化过程慢，因 此di-8-ANEPPS（8个碳原子）较di-4-ANEPPS（4个碳原子）染料性能 优良
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 3）染料的毒副作用。电压敏感染料对被染材料会产生药理性毒副作用。 在光强较大时，除了伴有光动力学损伤和光毒性作用外，还会造成被 染物质本身电活动的改变。如对心肌细胞，用1W/cm2的光强照射1分钟 将引起细胞逐步除极，动作电位幅度衰减，后除极现象甚至触发激动 的产生，直至细胞的死亡。实验显示染料RH421、di-8-ANEPPS和di-4- ANEPPS会增加心肌细胞的收缩而RH-414则会引起血管的收缩。与吸光 性染料相比，荧光染料都具有潜在的光毒性。光强越大，毒副作用越 明显。且内化的染料分子会加剧这种毒副作用
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 目前对染料毒副作用的机制还不十分清楚。但有资料显示 电压敏感染料可能与细胞膜电压门控通道直接作用，改变 了这些通道的电导和时间依从关系，从而改变了细胞正常 的生理特性。因此，应尽量选择毒副作用较小的染料，且 在不影响系统信噪比的情况下，注意控制染料浓度和曝光 时间
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 用于心脏电生理研究的染料应具有以下特点: ①能够被快速吸收,并且有很强的光子发射（photon emission） 效能； ②激发光和发射光的光谱可以很好的分离； ③光漂白过程较慢； ④可以被反复激发（ excitation）并发射（emission）荧光, 便于记录。 目前，在心脏的光学标测实验研究中常用di-8-ANEPPS（8 个碳原子）和di-4-ANEPPS（4个碳原子）作为分子探针。 这种染料对电场变化响应速度快，属快反应染料
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 图4-2为电压敏感染料di-8-ANEPPS的分子结构（（a））及细胞除极过程中染料 的光谱迁移（（b））。 由于这类染料呈两性分子结构，使其易于嵌入到细胞膜的磷脂双分子层上，含 有+N的一端朝细胞内部排列。当细胞除极化时，细胞膜与染料分子相互作用， 细胞膜内侧和外侧的染料分子重新排列和旋转。 于是，当膜电位由-Vm变化到+Vm时，染料的结构由于电场力的作用而改变， 造成光谱向左侧的短波长区域迁移（即蓝移）（图中虚线），从而产生荧光强 度的变化。荧光光谱迁移越大，相同膜电位下光强变化越明显。 4-2染料di-8-ANEPPS的结构（a）及细胞除极过程中di-8-ANEPPS的光谱迁移（b）
Xi’an Jiaotong Jiaotong Jiaotong University University University 4.1.1 基本原理 图4-3为分别采用光学标测和玻璃微电极记录到的动作电位。可以看到，两者具有较好的 一致性，但光标测信号由于受运动伪迹的影响，复极化时噪声相对偏大。此外，光标测 记录动作电位的幅度仅为荧光强度的相对值,因此不能用电压单位mV表示