实验17荧光定量PCR仪的光路校准 实验目的 1.掌握荧光定量PCR仪的基本结构、检测原理。 2.熟悉荧光定量PCR仪的光路校准， 实验器材 以卤钨灯为光源的荧光定量PCR仪一台，专用绿色校准纸板一个。 实验原理 荧光定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PC进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR仪是在普通PCR仪基础 上增加了荧光检测和分析系统，在PCR的每一循环结束时，仪器的卤钨灯光源发 射出激发光经过滤光器、分光镜、折射镜和透镜，最后投射扩增管的反应液中 反应液中的荧光物质受到激发光的激发后，产生特定的发射光，经透镜、折射镜、 分光镜和多透镜，最后在CCD相机上成像（见图17-1）。图像传输给计算机软件 系统，经分析后显示出荧光强度增长曲线，荧光的强弱与标本中的DM量成正比。 图17-1荧光定量CR仪检测原理 仪器描述 荧光定量PCR仪主要由96O0型PCR仪、微量荧光检测光学系统、微电路控 制系统、计算机及应用软件组成。荧光信号的正确采集是获得准确分析结果的前
实验 17 荧光定量 PCR 仪的光路校准 实验目的 1．掌握荧光定量 PCR 仪的基本结构、检测原理。 2．熟悉荧光定量 PCR 仪的光路校准。 实验器材 以卤钨灯为光源的荧光定量 PCR 仪一台，专用绿色校准纸板一个。 实验原理 荧光定量 PCR 是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术。是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量 PCR 仪是在普通 PCR 仪基础 上增加了荧光检测和分析系统，在 PCR 的每一循环结束时，仪器的卤钨灯光源发 射出激发光经过滤光器、分光镜、折射镜和透镜，最后投射扩增管的反应液中， 反应液中的荧光物质受到激发光的激发后，产生特定的发射光，经透镜、折射镜、 分光镜和多透镜，最后在 CCD 相机上成像（见图 17-1）。图像传输给计算机软件 系统，经分析后显示出荧光强度增长曲线，荧光的强弱与标本中的 DNA 量成正比。 图 17-1 荧光定量 PCR 仪检测原理 仪器描述 荧光定量 PCR 仪主要由 9600 型 PCR 仪、微量荧光检测光学系统、微电路控 制系统、计算机及应用软件组成。荧光信号的正确采集是获得准确分析结果的前
提条件，仪器光学系统的工作是否正常决定荧光信号的准确采集。因此，当仪器 初次安装、检修、拆装、更换光源或仪器搬动后，均应重新进行光路校准。 实验步骤 1.产生CCD图像 (1)开计算机和灯电源：(2)把校准纸板放在PCR的96孔样品槽上；(3) 把检测器上的热盖向前推到底并向下拧紧：(4)在START上轻点，选择并进入 SDS manager;(5)在SDS manager软件屏幕中：把检测区值(ROI)设为17， 参考值(reference)设为40，积分时间设为512ms:(6)选择shutter open: (打√为选中)(7)点击1ive(击活)钮取样试验纸板的CCD图像，此时可见96 孔图像，亮度与荧光强度成正比：(8)在图像出现后于图像任何地方点击停止取 样。 2.参考框条(Reference Strip)调整： 在CCD图像的上部用六个长方形框来代表不同的光强度，调整的目的是让每 一长方形框只容纳一种发射强度的光，右边的框代表强度最强的光，从右到左光 强依次减弱，每一长方形框必须只包含一种强度的光。 (1)把积分时间设为512ms:(②)按1ive采样，得到图像后，再点1ive停止 采样；(3)按调节点位置进行调整，直到达成目标（见图37-2）。(4)增加积分时 间到1024ms,重复(3)；（⑤）增加积分时间到2048m5,重复(3)：(6)增加积分时 间到4096ms,重复(3)：(7)减少积分时间到2048ms,检查参考框条位置是否还 是正常，一步步减到512ms并检查位置是否正常。 若一次调整不理想，则可以多次调整，直到满意为止。 亮度分界线 512ms最亮光框 1024ms最亮光框 2048ms最亮光框 4096ms最亮光框 图17-2参考框条调整的日标图
提条件，仪器光学系统的工作是否正常决定荧光信号的准确采集。因此，当仪器 初次安装、检修、拆装、更换光源或仪器搬动后，均应重新进行光路校准。 实验步骤 1．产生 CCD 图像 （1）开计算机和灯电源；（2）把校准纸板放在 PCR 的 96 孔样品槽上；（3） 把检测器上的热盖向前推到底并向下拧紧；（4）在 START 上轻点，选择并进入 SDS manager；（5）在 SDS manager 软件屏幕中：把检测区值（ROI）设为 17， 参考值（reference）设为 40，积分时间设为 512ms；（6）选择 shutter open； (打√为选中)（7）点击 live（击活）钮取样试验纸板的 CCD 图像，此时可见 96 孔图像，亮度与荧光强度成正比；（8）在图像出现后于图像任何地方点击停止取 样。 2．参考框条(Reference Strip)调整： 在 CCD 图像的上部用六个长方形框来代表不同的光强度，调整的目的是让每 一长方形框只容纳一种发射强度的光，右边的框代表强度最强的光，从右到左光 强依次减弱，每一长方形框必须只包含一种强度的光。 (1)把积分时间设为 512ms；(2)按 live 采样，得到图像后，再点 live 停止 采样；(3)按调节点位置进行调整，直到达成目标（见图 37-2）。(4)增加积分时 间到 1024ms，重复(3)；(5)增加积分时间到 2048ms，重复(3)；(6)增加积分时 间到 4096ms，重复(3)；(7)减少积分时间到 2048ms，检查参考框条位置是否还 是正常，一步步减到 512ms 并检查位置是否正常。 若一次调整不理想，则可以多次调整，直到满意为止。 图 17-2 参考框条调整的目标图 亮度分界线 512ms 最亮光框 1024ms 最亮光框 2048ms 最亮光框 4096ms 最亮光框
3.自动ROI校准 在调整好参考框条位置后，调节积分时间直到96孔都清晰可见，注意只要 能分辨即可，不要太强。然后在Edit菜单中，选择Calibrate ROI 如自动OI校准不能运行，或校准完成后孔的形状奇形，则可以先用 Edit/Reset Calibration复位，然后用手动ROI调整的方法对准96孔位。调整 点位置见图37-3，调整的目标是尽量使96个光斑都在各自的蓝孔中间。 96孔光 一蓝孔 0大 图17-3手动调整96孔位置的调节点位置及作用 4.设定增益Gain及偏差Bias (I)在Edit菜单下，选择Linearity Calibration,在对话框弹出后，输入 密码。 (②)把Gain及Bias设定到在重装软件前记下的相应数值，然后调节Bias 值使medium Pixel的值为10±2. (3)选择start启动Linearity calibrations: (4)调节Gain把线性回归(Linear regression)的值调到10±2。（若 regression太大，则增加Gain,否则减少Gain),重调Bias使medium Pixel 值为10±2。 (⑤)反复调节Gain和Bias,使mediumpixel的值和Linear regression每 次的值均为10士2。 (6)在设定好Gain和Bias后，按Calculate,仪器会自动运行并计算offset 值，完成计算后再次重新设定Gain和Bias并满足medium pixel的值和Linear regression的值为10士2的条件后按OK值退出。 5.选择QUIT退出SDS manager软件，光路校准完毕。 思考题
3．自动 ROI 校准 在调整好参考框条位置后，调节积分时间直到 96 孔都清晰可见，注意只要 能分辨即可，不要太强。然后在 Edit 菜单中，选择 Calibrate ROI。 如自动 ROI 校准不能运行，或校准完成后孔的形状奇形，则可以先用 Edit/Reset Calibration 复位，然后用手动 ROI 调整的方法对准 96 孔位。调整 点位置见图 37-3，调整的目标是尽量使 96 个光斑都在各自的蓝孔中间。 图 17-3 手动调整 96 孔位置的调节点位置及作用 4．设定增益 Gain 及偏差 Bias (1) 在 Edit 菜单下，选择 Linearity Calibration，在对话框弹出后，输入 密码。 (2) 把 Gain 及 Bias 设定到在重装软件前记下的相应数值，然后调节 Bias 值使 medium Pixel 的值为 10±2。 (3) 选择 start 启动 Linearity calibration； (4) 调节 Gain 把线性回归（Linear regression）的值调到 10±2。（若 regression 太大，则增加 Gain ，否则减少 Gain），重调 Bias 使 medium Pixel 值为 10±2。 (5) 反复调节 Gain 和 Bias，使 medium pixel 的值和 Linear regression 每 次的值均为 10±2。 (6) 在设定好 Gain 和 Bias 后，按 Calculate，仪器会自动运行并计算 offset 值，完成计算后再次重新设定 Gain 和 Bias 并满足 medium pixel 的值和 Linear regression 的值为 10±2 的条件后按 OK 值退出。 5．选择 QUIT 退出 SDS manager 软件，光路校准完毕。 思考题 96 孔光 蓝孔 斑
1.简述荧光定量PCR仪的检测原理。 2.简述哪些情况下需进行光路校准和光路校准的步骤？
1.简述荧光定量 PCR 仪的检测原理。 2.简述哪些情况下需进行光路校准和光路校准的步骤？