实验15流式细胞仪的使用与常见故障的排除 实验目的 1.掌握流式细胞仪的基本结构和工作原理。 2.熟悉流式细胞仪常见故障的排除方法。 3.了解利用流式细胞仪进行免疫荧光分析的过程。 实验器材 流式细胞仪一台，四色荧光微球(Flow-check)一瓶，抗CD3-PECy5、抗 CD4-FITC和抗CD8-PE荧光标记抗体，溶血剂(A液和B液). 实验原理 将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管。在气体压 力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入其流动室，沿流 动室的轴心向下流动，轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液 流，鞘液流和样品流在喷嘴附近组成一个圆形流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水 平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区（见图15-1）。染色的细胞受激光 照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈90角方向放置的光电倍 增管荧光检测器和前向角放置的光电二级管散射光检测器接收，经过转换器转换 为电子信号后，输入电子信号接收器。计算机通过相应的软件分析这些数字化信 息，就可得到细胞的大小和活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。 在压电晶体上加上频率为30kz的信号，使之产生同颜率的机械振动，流动 室随之振动，通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。由于各类细胞的特性 信息在细胞形成液滴以前在测量区己经被测定，并储存在计算机中，因此，当某 类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给 含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，而不符合分选条件的含细胞液滴及不含细 胞的空白液滴不被充电，也就不带电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压 静电场时，依所带电荷符号向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，不带电 荷的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中而排出，从而达到细胞分类收集的目的。 仪器描述 流式细胞仪由光源、液流系统、信号接收、信号处理和细胞分选五部分组 成，见图15-2
实验 15 流式细胞仪的使用与常见故障的排除 实验目的 1.掌握流式细胞仪的基本结构和工作原理。 2.熟悉流式细胞仪常见故障的排除方法。 3.了解利用流式细胞仪进行免疫荧光分析的过程。 实验器材 流式细胞仪一台，四色荧光微球（Flow-check）一瓶，抗 CD3-PEcy5、抗 CD4-FITC 和抗 CD8-PE 荧光标记抗体,溶血剂（A 液和 B 液）。 实验原理 将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管。在气体压 力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入其流动室，沿流 动室的轴心向下流动，轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液 流，鞘液流和样品流在喷嘴附近组成一个圆形流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水 平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区（见图 15-1）。染色的细胞受激光 照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈 900角方向放置的光电倍 增管荧光检测器和前向角放置的光电二级管散射光检测器接收，经过转换器转换 为电子信号后，输入电子信号接收器。计算机通过相应的软件分析这些数字化信 息，就可得到细胞的大小和活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。 在压电晶体上加上频率为 30kHz 的信号，使之产生同频率的机械振动，流动 室随之振动，通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。由于各类细胞的特性 信息在细胞形成液滴以前在测量区已经被测定，并储存在计算机中，因此，当某 类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给 含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，而不符合分选条件的含细胞液滴及不含细 胞的空白液滴不被充电，也就不带电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压 静电场时，依所带电荷符号向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，不带电 荷的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中而排出，从而达到细胞分类收集的目的。 仪器描述 流式细胞仪由光源、液流系统、信号接收、信号处理和细胞分选五部分组 成，见图 15-2
样品 压电品 流动室 光检测 激光光源 前向角 散射光检测器 日日白←分选容器 图11流式细胞仪的工作原理示意图 先一一风一您用 辑胞分选 图15-2流式细胞仪的结构示意图 1.光源光源有汞灯和激光。汞灯的结构简单、价格便宜、维修容易，但 在单一谱线上的功率较弱。激光单色性较好，功率强大、不易散焦，但结构复杂、 价格昂贵、维修困难。依据被激发的生物颗粒自身荧光物质或荧光染料的激发光 谱而决定选择哪种光源的哪条谱线作为激发光源。光谱的谱线越接近被激发物质 的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号越强。 2.液流系统液流系统包括喷嘴和流动室，是样品和鞘液进入、流动、排 出的通道。同轴流动设计使液体的流动以样品流居中、鞘液流包绕样品流形成流 束到达喷孔，使其以稳流的形式喷出。 3.信号接收系统细胞通过激光束时发出散射光和荧光，检测系统接收这 些散射光和荧光，并将其转换成与散射光和荧光量大小成正比的电压脉冲，通过 它可以区分不同的细胞。 4.细胞信号的处理检测器以每秒1000~2000细胞的速度探测细胞的散 射光和荧光信息，经过A/D转换器变成二进制信号，存储于计算机中。计算机通 过综合处理、分析这些信息，可直接计算出所需的各种结果
图 15-1 流式细胞仪的工作原理示意图 图 15-2 流式细胞仪的结构示意图 1．光源 光源有汞灯和激光。汞灯的结构简单、价格便宜、维修容易，但 在单一谱线上的功率较弱。激光单色性较好，功率强大、不易散焦，但结构复杂、 价格昂贵、维修困难。依据被激发的生物颗粒自身荧光物质或荧光染料的激发光 谱而决定选择哪种光源的哪条谱线作为激发光源。光谱的谱线越接近被激发物质 的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号越强。 2．液流系统 液流系统包括喷嘴和流动室，是样品和鞘液进入、流动、排 出的通道。同轴流动设计使液体的流动以样品流居中、鞘液流包绕样品流形成流 束到达喷孔，使其以稳流的形式喷出。 3．信号接收系统 细胞通过激光束时发出散射光和荧光，检测系统接收这 些散射光和荧光，并将其转换成与散射光和荧光量大小成正比的电压脉冲，通过 它可以区分不同的细胞。 4．细胞信号的处理 检测器以每秒 1000～2000 细胞的速度探测细胞的散 射光和荧光信息，经过 A/D 转换器变成二进制信号，存储于计算机中。计算机通 过综合处理、分析这些信息，可直接计算出所需的各种结果。 样品 压电晶体 鞘液 流动室 喷嘴 荧光检测器 激光光源 偏转板 分选容器 前向角 散射光检测器 液流 系统 信 号 处 理 信 号 接 收 光 源 源 液流 系统 信 号 接 收 光 源 源 液流 系统 信 号 接 收 光 源 源 细胞分选 信 号 处 理 液流 系统 信 号 接 收 光 源 源
5.细胞分选器细胞分选器由水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转 三部分组成，通过压电晶体的振动使自喷孔喷出的流束形成水滴。 实验步骤 (一)流式细胞仪的使用 1.四色荧光微球校正光路 (1)将Flo-check在室温下放置10min。 (2)选择检测FIow-check的PROTOCOL。 (3)取0.5ml(15滴~20滴)F1 ow check放入12mm×75mm流式细胞仪专用的 试管中。 (4)将试管放在样品台上进行检测，数5000(S)。 (5)记录FS及荧光FL~FL的HPCV值，HPCV的值应<2%（见表24-1）。 (6)若HPCV值不达标，应采取以下方法校正：①观察仪器预热时问题是否大 于20分钟：②按主机上PRIME键，排除气泡干扰后重测：③选择Cleaning Panel 清洗机器后重测：④若以上处理均未达标，请工程师进行光路调整。 (7)若长期不开机，开机后先清洗机器，再测Flow-check。. 2.免疫荧光分析 细胞表面的抗原（或细胞膜受体）与相应的荧光标记抗体结合，形成带有荧 光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪检测其荧光量，即得到细胞表面相应抗原 的表达情况。 (1)取10041全血加入到12mm×75m流式细胞仪专用试管中。 (2)加入适量荧光标记单抗，如抗CD3-PEcy10l、抗CD4-FITC10u1和抗 CD8-PE10L,加在同一标本管内，置室温暗处标记30min。 (3)溶解红细胞：①在标记试管内加入5000 ptolyse C,室温避光10min: ②加500μlPBS,室温避光10min:③1500rpm离心5min,弃上清液，加入1 ml PBS 悬浮细胞，待检测。 (4)同型对照管：加入IgG1-FITC/IgG1-PE/1gG1-PC510μL,其余步骤同测 定管。 (5)上机检测：仪器进入正常工作状态后，建立并选择CD4/CD8/CD3三色 检测方案，用同型对照管调电压。电压调节达到要求后对测定管进行检测。 (二)流式细胞仪常见故障的设置及排除
5．细胞分选器 细胞分选器由水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转 三部分组成，通过压电晶体的振动使自喷孔喷出的流束形成水滴。 实验步骤 （一）流式细胞仪的使用 1. 四色荧光微球校正光路 （1）将 Flow-check 在室温下放置 10min。 （2）选择检测 Flow-check 的 PROTOCOL。 （3）取 0.5ml(15 滴～20 滴)Flow check 放入 12mm×75mm 流式细胞仪专用的 试管中。 （4）将试管放在样品台上进行检测，数 5000(FS)。 （5）记录 FS 及荧光 FL1～FL4的 HPCV 值，HPCV 的值应<2%（见表 24-1）。 （6）若 HPCV 值不达标,应采取以下方法校正：①观察仪器预热时问题是否大 于 20 分钟；②按主机上 PRIME 键，排除气泡干扰后重测；③选择 Cleaning Panel 清洗机器后重测；④若以上处理均未达标, 请工程师进行光路调整。 （7）若长期不开机，开机后先清洗机器，再测 Flow-check。 2.免疫荧光分析 细胞表面的抗原（或细胞膜受体）与相应的荧光标记抗体结合，形成带有荧 光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪检测其荧光量，即得到细胞表面相应抗原 的表达情况。 （1）取 100µl 全血加入到 12mm×75mm 流式细胞仪专用试管中。 （2）加入适量荧光标记单抗，如抗 CD3-PEcy10µl、抗 CD4-FITC 10µl 和抗 CD8-PE 10µl,加在同一标本管内，置室温暗处标记 30min。 （3）溶解红细胞：①在标记试管内加入 500µl Optolyse C,室温避光 10min； ②加 500µl PBS，室温避光 10min；③1500rpm 离心 5min,弃上清液，加入 1ml PBS 悬浮细胞，待检测。 （4）同型对照管：加入 IgG1-FITC/IgG1-PE/IgG1-PC5 10µl,其余步骤同测 定管。 （5）上机检测：仪器进入正常工作状态后，建立并选择 CD4/CD8/CD3 三色 检测方案，用同型对照管调电压。电压调节达到要求后对测定管进行检测。 （二）流式细胞仪常见故障的设置及排除
1.鞘液压力故障及排除 (1)鞘液压力故障产生的原因：①未拧紧鞘液箱盖，使压力减小：②压力调 节阀漂移，导致Sheath pressure小于4PSI:③鞘液过滤器阻塞。 (2)鞘液压力故障的设置：在运转正常的流式细胞仪上，根据仪器的状态和 仪器使用人对仪器的熟悉程度，选择下面一种或几种方法，使仪器出现鞘液压力 故障。①拧松鞘液箱盖：②调节压力调节阀，使Sheath pressure小于4PSI: ③容易恢复的部分阻塞鞘液过滤器的方法。 (3)鞘液压力故障的显示：“Sheath pressure error”或“Sheath pressure warning”。 (4)鞘液压力故障的表现：主机上的信号指示二极管闪烁，样品液快速减少， 样品台抬起又自动降下。 (5)鞘液压力故障的排除：①拧紧鞘液箱盖，使压力增加：②调节压力调节 阀，使Sheath pressure为4PSI:③清除鞘液过滤器阻塞，或者更换过滤器。 (6)减少出现鞘液压力故障的预防：①补充鞘液和清洁液时，要拧紧盖子： ②每次开机前检查压力表是否在正常范围内：③鞘液盒和清洁盒的连接头应注意 定期更换或清洗。 2.系统压力故障及排除 (1)系统压力故障产生的原因：①由于系统内部压力小，使压力表和气泵压 力表显示值低：②气水隔离瓶漏气：③交流电磁阀不密封：④电源箱接头松动： ⑤主机管道可能漏气。 (2)系统压力故障的设置：在运转正常的流式细胞仪上，调节压力表使其小 于30PSI。 (3)系统压力故障的显示：“System pressure error”或“System pressure w arning”。 (4)系统压力故障的表现：系统进入自校状态，显示压力低，并停止检测。 (5)系统压力故障的排除：调节压力表使其等于或略大于30PS1。 (6)减少系统压力故障的措施：①每次检查压力表和气泵压力表是否正常： ②检查气水隔离瓶、交流电磁阀和主机管是否漏气：③检查电源箱面板快速接头 是否插紧。 3.样品流路阻塞及排除
1.鞘液压力故障及排除 （1）鞘液压力故障产生的原因：①未拧紧鞘液箱盖，使压力减小；②压力调 节阀漂移, 导致 Sheath pressure 小于 4 PSI；③鞘液过滤器阻塞。 （2）鞘液压力故障的设置：在运转正常的流式细胞仪上，根据仪器的状态和 仪器使用人对仪器的熟悉程度，选择下面一种或几种方法，使仪器出现鞘液压力 故障。①拧松鞘液箱盖；②调节压力调节阀, 使 Sheath pressure 小于 4 PSI； ③容易恢复的部分阻塞鞘液过滤器的方法。 （3）鞘液压力故障的显示：“Sheath pressure error” 或“Sheath pressure warning”。 （4）鞘液压力故障的表现：主机上的信号指示二极管闪烁，样品液快速减少， 样品台抬起又自动降下。 （5）鞘液压力故障的排除：①拧紧鞘液箱盖, 使压力增加；②调节压力调节 阀，使 Sheath pressure 为 4 PSI； ③清除鞘液过滤器阻塞, 或者更换过滤器。 （6）减少出现鞘液压力故障的预防：①补充鞘液和清洁液时，要拧紧盖子； ②每次开机前检查压力表是否在正常范围内；③鞘液盒和清洁盒的连接头应注意 定期更换或清洗。 2.系统压力故障及排除 （1）系统压力故障产生的原因：①由于系统内部压力小，使压力表和气泵压 力表显示值低；②气水隔离瓶漏气；③交流电磁阀不密封；④电源箱接头松动； ⑤主机管道可能漏气。 （2）系统压力故障的设置：在运转正常的流式细胞仪上，调节压力表使其小 于 30 PSI。 （3）系统压力故障的显示：“System pressure error” 或“System pressure w arning”。 （4）系统压力故障的表现：系统进入自校状态, 显示压力低，并停止检测。 （5）系统压力故障的排除：调节压力表使其等于或略大于 30 PSI。 （6）减少系统压力故障的措施：①每次检查压力表和气泵压力表是否正常； ②检查气水隔离瓶、交流电磁阀和主机管是否漏气；③检查电源箱面板快速接头 是否插紧。 3.样品流路阻塞及排除
(1)样品流路阻塞产生的原因：任何使样品流路上发生阻塞的故障。 (2)样品流路阻塞的设置：在运转正常的流式细胞仪上，弯折进样管 (3)样品流路阻塞的显示：进样时，FS/SS直方图中无点信号出现 (4)样品流路阻塞的表现：clean panel失灵，使用高浓度的漂白液和Prime 均无改善。单独使用clean panel和clean se程序时能吸样，但实际检测时无 法吸样。 (5)样品流路阻塞的排除：将弯折的进样管恢复正常。 (6)防止样品流路阻塞的措施：上机前，所有要经过样品管的溶液（包括样 品)均使用200目的滤网过滤，避免溶液中的杂质、细胞团或沉淀物阻塞样品 流路。 数据记录及处理 表15-1四色荧光微球校正光路PCY测定值 HPGV测定值 备注 FS FLa F凡L FL 表24-2外周血淋巴细胞亚群测定结果 测定值 备注 c03 CD4 CD8 注意事项 1.在进行四色荧光微球校正光路时，为了保持电压的稳定，首先应保证稳压 电源正常工作。 2.免疫荧光分析中，为了减少测定误差，所有操作环节尽可能在避光的条件 下进行。 3.流式细胞仪属于精密仪器设备，故障的设置及排除都要慎重
（1）样品流路阻塞产生的原因：任何使样品流路上发生阻塞的故障。 （2）样品流路阻塞的设置：在运转正常的流式细胞仪上，弯折进样管。 （3）样品流路阻塞的显示：进样时, FS/SS 直方图中无点信号出现。 （4）样品流路阻塞的表现：clean panel 失灵，使用高浓度的漂白液和 Prime 均无改善。单独使用 clean panel 和 clean se 程序时能吸样，但实际检测时无 法吸样。 （5）样品流路阻塞的排除：将弯折的进样管恢复正常。 （6）防止样品流路阻塞的措施：上机前，所有要经过样品管的溶液（包括样 品）均使用 200 目的滤网过滤，避免溶液中的杂质、细胞团或沉淀物阻塞样品 流路。 数据记录及处理 表 15-1 四色荧光微球校正光路 HPCV 测定值 HPCV 测定值 备注 FS FL1 FL2 FL3 FL4 表 24-2 外周血淋巴细胞亚群测定结果 测定值 备注 CD3 CD4 CD8 注意事项 1.在进行四色荧光微球校正光路时，为了保持电压的稳定，首先应保证稳压 电源正常工作。 2.免疫荧光分析中，为了减少测定误差，所有操作环节尽可能在避光的条件 下进行。 3.流式细胞仪属于精密仪器设备，故障的设置及排除都要慎重
思考题 1.简述流式细胞仪的工作原理。 2.流式细胞仪由哪几个部分构成？ 3.如何校正流式细胞仪的光路？ 3。简述流式细胞仪容易发生哪些故障？如何排除？
思考题 1. 简述流式细胞仪的工作原理。 2. 流式细胞仪由哪几个部分构成？ 3. 如何校正流式细胞仪的光路？ 3. 简述流式细胞仪容易发生哪些故障？如何排除？