实验12高效液相色谱仪的使用及运行性能测试 实验目的 1.了解高效液相色谱仪的基本原理和结构。 2.掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。 3.掌握测试高效液相色谱仪运行性能的指标和方法，验证各部件及整机的性 能。 实验器材 高效液相色谱仪，LC-ATvp高压泵、SCL-I0Avp程序控制器、SPD-M1OAvp 二极管阵列检测器、CT0-10Asvp温度控制器。Shim-packVP-ODS Cm150X4.6m 分析柱、20ul进样器、AS3210型超声波发生器。无水甲醇和双蒸水各500ml(脱 气处理)、萘、咖啡因（均为色谱纯或分析纯）。 实验原理 高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动 相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成 分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到 测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离 性能高、分析速度快的特点。 仪器描述 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组 成。LC-2010和Agilent1100型为单泵型，适于单一流动相的洗脱：LC-10Avp 型为双泵型高效液相色谱仪，适于程序洗脱。单泵型高效液相色谱仪的结构示意 见图12-1。 实验步骤 (一)高效液相色谱仪的基本操作步骤（以岛津LC-10A为例） 1.依照顺序开机，自检完毕后进入操作模板： 2.设定洗脱程序、检测器的条件及测定报告： 3.完成实验过程，打印试验结果，依照顺序关机。 (二)性能测试
实验 12 高效液相色谱仪的使用及运行性能测试 实验目的 1.了解高效液相色谱仪的基本原理和结构。 2.掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。 3.掌握测试高效液相色谱仪运行性能的指标和方法，验证各部件及整机的性 能。 实验器材 高效液相色谱仪，LC-ATvp 高压泵、SCL-10Avp 程序控制器、SPD-M10Avp 二极管阵列检测器、CTO-10Asvp 温度控制器。Shim-packVP-ODS C18 150×4.6mm 分析柱、20μl 进样器、AS3210 型超声波发生器。无水甲醇和双蒸水各 500ml（脱 气处理）、萘、咖啡因（均为色谱纯或分析纯）。 实验原理 高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动 相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成 分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到 测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离 性能高、分析速度快的特点。 仪器描述 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组 成。LC-2010 和 Agilent1100 型为单泵型，适于单一流动相的洗脱；LC-10Avp 型为双泵型高效液相色谱仪，适于程序洗脱。单泵型高效液相色谱仪的结构示意 见图 12-1。 实验步骤 （一）高效液相色谱仪的基本操作步骤（以岛津 LC-10A 为例） 1.依照顺序开机，自检完毕后进入操作模板； 2.设定洗脱程序、检测器的条件及测定报告； 3.完成实验过程，打印试验结果，依照顺序关机。 （二） 性能测试
高效液相色谱仪的性能检查分为单个部件的验证和整机验证。验证时一般先 验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能 验证。验证目的是检查并确认高效液相色谱仪运行性能是否符合要求。 1.验证标准 按照中华人民共和国国家计量检定规程，高效液相色谱仪各验证部件的验证 项目的合格标准见表12-1。 玉输液泵 压力脉动阻滞 8888 自动收集器 图121高效液相色谱仪结构示意图 表12-1高效液相色请各险证部件的验证项目的合格标准 验证部件 验证项目 合格标准 流量设定值误差5 输液系 2.0ml.min:<2% 0.5ml.min:<3%: 流量稳定性误差S, 1.0ml.min:<2% 2.0ml.min:<2% 柱温箱设定值误差△1， <±2C 柱温箱 柱温箱控温稳定性【。 ≤1℃ 自动进样器 进样量准确度误差 ≤±2% 检测器 基线噪声 ≤2X103AU
高效液相色谱仪的性能检查分为单个部件的验证和整机验证。验证时一般先 验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能 验证。验证目的是检查并确认高效液相色谱仪运行性能是否符合要求。 1.验证标准 按照中华人民共和国国家计量检定规程，高效液相色谱仪各验证部件的验证 项目的合格标准见表 12-1。 图 12-1 高效液相色谱仪结构示意图 表 12-1 高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准 验证部件 验证项目 合格标准 输液泵 流量设定值误差 Ss 0.5ml.min-1 : < 5%； 1.0ml.min-1 : < 3% 2.0 ml.min-1 : < 2% 流量稳定性误差 SR 0.5ml.min-1 : < 3%； 1.0ml.min-1 : < 2% 2.0 ml.min-1 : < 2% 柱温箱 柱温箱设定值误差 ΔTs < ±2℃ 柱温箱控温稳定性 Tc ≤1℃ 自动进样器 进样量准确度误差 ≤±2% 检测器 基线噪声 ≤2×10-5 AU 高压输液泵 检测器 计算机 液瓶 色 谱 柱 自动收集器 检测器 -计算机界面装置 压力脉动阻滞器 过 滤 器 梯度 洗脱 装置
最小检测浓度 ≤1×107g.m1'(禁的甲醇溶液) 基线漂移 ≤5X10'AU.h 定性测量重复性误差 RSD≤0.5% 整机性能 定量测量重复性误差 RSD≤1.0% 2.验证步骤 (1)输液泵泵流量设定值误差S、流量稳定性误差S的检定 将仪器的各部分联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.OmL.min,按说明 书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表12-2设定相应数值，待流速稳定 后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时， 准确地收集，称重。按式(1)、式(2)计算S和S,结果填入数据记录与处理的 表12-3中。 表12-2流量、次数、收集时间表 流量设定值(L/min) 0.5 1.0 2.0 测量次数 3 3 流动相收集时间(min) 10 5 S=(.-F)/Fs×100% .(1) Sx=(F-F)/FX100% 式中：Ss:流量设定值误差(%)：Fs:流量设定值(mL.min): S:流量稳定性误差(%)；F:同一组测量值的算术平均值(ml.min): Fr:同一组测量中流量最大值(mL.min):F:同一组测量中流量最小值 (ml.min):F,为流量实测值(ml.min),其值由下式计算： F.=(W2-Wi)/prt .(3) 其中：：容量瓶+流动相的重量(g):W:容量瓶的重量(g): p:实验温度下流动相的密度(g.cm):t:收集流动相的时间(mi) (2)柱温箱柱箱温度设定值误差△T,和控温稳定性T的检定 将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择35℃和45℃进行检定。按仪器说 明书操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开始计时，以后每隔 10min记录一次读数，共计7次，求出平均值。平均值与设定值之差为△Ts,7 次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性Tc,结果填入数据记录与处理的表
最小检测浓度 ≤1×10-7 g.ml-1 (萘的甲醇溶液) 基线漂移 ≤5×10-4 AU.h-1 整机性能 定性测量重复性误差 RSD≤0.5% 定量测量重复性误差 RSD≤1.0% 2.验证步骤 （1） 输液泵泵流量设定值误差 SS、流量稳定性误差 SR的检定 将仪器的各部分联接好，以甲醇为流动相，流量设为 1.0mL.min-1，按说明 书启动仪器，待压力平稳后保持 10 分钟，按表 12-2 设定相应数值，待流速稳定 后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时， 准确地收集，称重。按式(1)、式(2)计算 SS和 SR，结果填入数据记录与处理的 表 12-3 中。 表 12-2 流量、次数、收集时间表 流量设定值（mL/min） 0.5 1.0 2.0 测量次数 3 3 3 流动相收集时间（min） 10 5 5 SS＝(Fm－FS)/FS×100% . (1) SR＝(Fmax－Fmin)/F×100% . (2) 式中：SS：流量设定值误差(％)；FS：流量设定值(mL.min-1 )； SR：流量稳定性误差(％)；F：同一组测量值的算术平均值(mL.min-1 )； Fmax：同一组测量中流量最大值(mL.min-1 )；Fmin：同一组测量中流量最小值 (mL.min-1 )；Fm为流量实测值(mL.min-1 )，其值由下式计算： Fm＝(W2－W1)/ ρT•t . (3) 其中： W2：容量瓶＋流动相的重量(g)；W1：容量瓶的重量(g)； ρT：实验温度下流动相的密度(g.cm -3 )；t：收集流动相的时间(min)； （2） 柱温箱柱箱温度设定值误差 ΔTS和控温稳定性 TC的检定 将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择 35℃和 45℃进行检定。按仪器说 明书操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开始计时，以后每隔 10 min 记录一次读数，共计 7 次，求出平均值。平均值与设定值之差为 ΔTS，7 次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性 TC，结果填入数据记录与处理的表
12-4中. (3)自动进样器进样量准确度误差的检定 取1.5ml进样瓶装入1ml水，用天平精密称定其重量，然后置于自动进样器 上让其进样10次，每次50μ1。进样完成后再精密称定其重量，由重量差计算 进样量准确度，结果填入数据记录与处理的表12-5中。 (4)检测器的检定 ①检测器基线噪声和基线漂移的测定取Cs色谱柱，以100%甲醇为流动相， 流量为1.0ml.min,检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后（约 60min)记录基线60min,从30min内基线上读出噪音值：从60min基线上读出 基线漂移值。 ②检测器最小检测浓度的测定取C:色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量 为1.0ml.min'，检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后取 1×10gml的萘/甲醇溶液进样20μ1，记录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声 峰峰高算按照下列公式计最小检测浓度C。 C=(2×N×C)/H 式中：C:最小检测浓度，g.ml；:基线噪声峰峰高，m C:标准溶液浓度，g.m,H:标准溶液峰峰高，m 实验结果填入数据记录与处理的表12-6中。 (5)整机性能的检定 取C.色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml.min,检测器波长设定 为254nm(当选用萘时)或272nm(当选用咖啡因时)，柱温设定为40℃。开机 预热待仪器稳定后取0.1mg.ml的茶/甲醇溶液或0.02g.ml的咖啡因甲醇溶液 进样10μ1，连续进样6次，记录其峰面积和保留时间，以保留时间计算其定性 测量重复性误差，以峰面积计算其定量测定重复性误差。实验结果填入数据记录 与处理的表12-7中。 数据记录与处理 将上述的实验数据记录于下列各表，并进行相应的数据处理，得出检定结论。 (1)输液泵泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S的检定 表12-3输液泵泵流量设定值误差、流量稳定性误差的检定结果
12-4 中。 （3） 自动进样器进样量准确度误差的检定 取 1.5ml 进样瓶装入 1ml 水，用天平精密称定其重量，然后置于自动进样器 上让其进样 10 次，每次 50μl。进样完成后再精密称定其重量，由重量差计算 进样量准确度，结果填入数据记录与处理的表 12-5 中。 （4） 检测器的检定 ①检测器基线噪声和基线漂移的测定 取 C18色谱柱，以 100%甲醇为流动相， 流量为 1.0ml.min-1，检测器波长设定为 254nm，开机预热，待仪器稳定后（约 60min）记录基线 60min，从 30min 内基线上读出噪音值；从 60min 基线上读出 基线漂移值。 ②检测器最小检测浓度的测定 取 C18 色谱柱，以 100%甲醇为流动相，流量 为 1.0ml.min-1，检测器波长设定为 254nm，开机预热 ，待仪器稳定后取 1×10-7 g.ml-1的萘/甲醇溶液进样 20μl，记录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声 峰峰高算按照下列公式计最小检测浓度 CL。 CL=(2×Nd×C)/H 式中: CL：最小检测浓度，g.ml-1； Nd：基线噪声峰峰高，mm； C：标准溶液浓度，g.ml-1； H：标准溶液峰峰高，mm。 实验结果填入数据记录与处理的表 12-6 中。 （5）整机性能的检定 取 C18色谱柱，以 100%甲醇为流动相，流量为 1.0ml.min-1，检测器波长设定 为 254nm（当选用萘时）或 272nm（当选用咖啡因时）,柱温设定为 40℃。开机 预热待仪器稳定后取 0.1mg.ml-1的萘/甲醇溶液或 0.02mg.ml-1的咖啡因甲醇溶液 进样 10μl，连续进样 6 次，记录其峰面积和保留时间，以保留时间计算其定性 测量重复性误差，以峰面积计算其定量测定重复性误差。实验结果填入数据记录 与处理的表 12-7 中。 数据记录与处理 将上述的实验数据记录于下列各表，并进行相应的数据处理，得出检定结论。 （1） 输液泵泵流量设定值误差 SS、流量稳定性误差 SR的检定 表 12-3 输液泵泵流量设定值误差 SS、流量稳定性误差 SR 的检定结果
液相色洁仪型号： 泵型号： 流动相： 色诰柱： 鉴定日期： 检定人： 核人 0.5 ml.min 1.0 ml.min 2.0 ml.min 1次2次3次1次2次3次 1次2次3次 w w t T PT Fm=h-Wh)Mr·t Ss=(F-Fs)/Fsx100% 平均Ss F=(Fm1+Fm2+Fm3)/3 Fmar Fmin SR=(Fmax-Fmn)/Fx10 0% 此项检定结论： (2)柱温箱柱箱温度设定值误差△T,和控温稳定性T的检定 表12-4柱温箱柱箱温度设定值误差△了，和控温确定性1。的检定结果 液相色谱仪型号： 柱温箱型号： 数字温度仪型号： T蚊 35℃ 45℃ 时间 读数 时间 读数 稳定时
液相色谱仪型号： 泵型号： 流动相： 色谱柱： 鉴定日期： 检定人： 复 核人： Fs 0.5 ml.min-1 1.0 ml.min-1 2.0 ml.min-1 1 次 2 次 3 次 1 次 2 次 3 次 1 次 2 次 3 次 W1 W2 t T ρT Fm=(W2-W1)/ ρT·t SS＝(Fm－FS)/FS×100% 平均 SS F=(Fm1+Fm2+Fm3)/3 Fmax Fmin SR＝(Fm ax－Fmi n)/F×10 0% 此项检定结论： （2）柱温箱柱箱温度设定值误差 ΔTS 和控温稳定性 TC 的检定 表 12-4 柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS 和控温稳定性 TC 的检定结果 液相色谱仪型号： 柱温箱型号： 数字温度仪型号： T 设定 35℃ 45℃ 时间 读数 时间 读数 稳定时
第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次 第7次 T T中 △T=TT就 Te =T ax-Tas 此项检定结论： (3)自动进样器进样量准确度误差的检定 表125自动进样最进样量准确度误差的检定结果 液相色诺仪型号： 自动进样器型号： 检定温度：℃ 进样前进样瓶加水的总重W,(g)进样后进样瓶加水的总重(g)水的密度p(g进样量准确度误差(%) 进样量准确度误差=[（仰-）-(50×10×10×p)]/(50×10×10×p)×100% 此项检定结论： (4)检测器的检定 表126检测器的检定结果 液相色谱仪型号： 检测器型号： 色谱柱： 流动相： 流速： 黎甲醇标准溶液浓度C: 配制人： 配制日期： 基线噪声N。 基线漂移H 最小检测浓度C
第 1 次 第 2 次 第 3 次 第 4 次 第 5 次 第 6 次 第 7 次 T 平均 T 最大 T 最小 ΔTs=T 平均-T 设定 Tc =T 最大-T 最小 此项检定结论： （3） 自动进样器进样量准确度误差的检定 表 12-5 自动进样器进样量准确度误差的检定结果 进样量准确度误差=[(W1-W2)-(50×10×10-3×ρ)]/（50×10×10-3×ρ）×100% 此项检定结论： （4） 检测器的检定 表 12-6 检测器的检定结果 液相色谱仪型号： 检测器型号： 色谱柱： 流动相： 流速： 萘甲醇标准溶液浓度 C： 配制人： 配制日期： 基线噪声 Nd 基线漂移 H 最小检测浓度 CL 液相色谱仪型号： 自动进样器型号： 检定温度： ℃ 进样前进样瓶加水的总重 W1（g） 进样后进样瓶加水的总重 W2(g) 水的密度 ρ (g/ml) 进样量准确度误差(%)
最小检测浓度的计算：C=(2XN×C) 此项检定结论： (5)高效液相色谱仪整机性能的检定 表12-7整机性能的检定结果 液相色诺仪型号： 检测器型号 色谱柱： 检测波长： nm流动相 标准溶液类型： 浓度： 配制人： 配制日期 定性测定（保留时间） 定量测定（峰而积） 第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次 平均值 测量误差的RSD 备注：测量误差的RSD采用XCH函数表格计算 此项检定结论 高效液相色谱仪的验证结果分析和综合评价 根据实验测定结果，讨论说明高效液相色谱仪整体运行性能状况。 思考题 1.简述高效液相色谱仪的基本结构。 2。简述高效液相色谱仪的基本操作步骤。 3。高效液相色谱仪的性能验证有那些内容？如何进行？
最小检测浓度的计算: CL=(2×Nd×C)/H 此项检定结论： （5） 高效液相色谱仪整机性能的检定 表 12-7 整机性能的检定结果 液相色谱仪型号： 检测器型号： 色谱柱： 检测波长： nm 流动相： 流速： 标准溶液类型： 浓度： 配制人： 配制日期： 定性测定（保留时间） 定量测定（峰面积） 第 1 次 第 2 次 第 3 次 第 4 次 第 5 次 第 6 次 平均值 测量误差的 RSD 备注：测量误差的 RSD 采用 EXCEL 函数表格计算 此项检定结论： 高效液相色谱仪的验证结果分析和综合评价 根据实验测定结果，讨论说明高效液相色谱仪整体运行性能状况。 思考题 1. 简述高效液相色谱仪的基本结构。 2. 简述高效液相色谱仪的基本操作步骤。 3. 高效液相色谱仪的性能验证有那些内容？如何进行？