实验大 实验五培养基的制备、 器具包扎和灭菌
实 验 六 实验五 培养基的制备、 器具包扎和灭菌
目的要求 。了解培养基的配制原理和方法，掌握其 配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和 加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工 作及操作方法
目 的 要 求 ⚫ 了解培养基的配制原理和方法，掌握其 配制过程。 ⚫ 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和 加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 ⚫ 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工 作及操作方法
实验原理 培养基 (据组成成分可分为： 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物 质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 剧用途可分为 1.基础培养基：能满足各种微生物的营养需求 加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质， 使其快速生长，便于分离 3.选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目 标微生物得到富集，便于分离 4.鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性
实验原理 培养基 据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物 质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 剧用途可分为 1.基础培养基：能满足各种微生物的营养需求 加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质， 使其快速生长，便于分离 3.选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目 标微生物得到富集，便于分离 4.鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性
。从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂 的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2一0.5%凝固 剂而成的半固体状培养基
⚫ 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂 的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固 剂而成的半固体状培养基
表6-1琼脂与明胶特性比较 比较项目 琼脂 明胶 此较项目 琼脂 明胶 培点（℃） 96 25 效生物可利用性 绝大多数微生物 部分微生物 餐围点(C) 40 20 不能水解利用 能水解利用 酸碱度 效酸 酸性 耐热性 强 弱 灰分(%) 16.0 14.0-15.0 来源 被物 助物 氧化钙() 1.15 0.0 化学本质 多糖 蛋白质 氧化镁() 0.77 0.0 常用浓度(%) 1,5-2 5-12 烈(%) 0.40 183
常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉
消毒：使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的 方法。 灭菌：采用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物的方 法。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 加压蒸汽灭菌法其步骤如下： 1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。 2.接通电源，进行加热 3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大 气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到 0.5kg/cm时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气 阀。 4.当压力达1.05kg/cm时，此时灭菌器内的温度为121℃， 维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸 等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开 排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品
⚫ 消毒：使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的 方法。 ⚫ 灭菌：采用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物的方 法。 ⚫ 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 ⚫ 加压蒸汽灭菌法其步骤如下： 1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。 2.接通电源，进行加热 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大 气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到 0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气 阀。 4.当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为1210C， 维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸 等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开 排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品
表6一2 菌体蛋白质的凝固温度与其 含水量的关系 蛋白含水量(%) 凝固温度（℃） 50 56 25 74-80 18 80—90 6 145 0. 160-170 表6-3加压蒸汽灭菌器压力数与蒸汽温度间的关系 压力表所示压力 全部水蒸汽（无空气） 50%空气 全部空气 bl/in2 kg/cm2 5 0.35 108℃ 94℃ 72℃ 10 0.7 115℃ 105℃ 90℃ 15 1.05 -121℃ 112℃ 100℃ 20 1.41 126℃ 118℃ 109℃
间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天 蒸煮1次，每次煮沸1h,连续3d重复进行。 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基） 放在37℃恒温条件下培养过夜，这样可以 使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营 养体，以便下次蒸煮时杀灭。 过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、 血清)，一般可用细菌过滤器进行除菌
⚫ 间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天 蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基） 放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以 使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营 养体，以便下次蒸煮时杀灭。 ⚫ 过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、 血清），一般可用细菌过滤器进行除菌
紫外线灭菌法： 一 般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开 紫外线照射0.5h,就使室内空气灭菌。若照射 紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强 灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透 力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫 外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 。化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲 醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、 漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是 杀菌剂，有的是抑菌剂
⚫ 紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开 紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射 紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强 灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透 力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫 外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 ⚫ 化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲 醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、 漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是 杀菌剂，有的是抑菌剂
表6一4常用化学抑菌剂和杀菌剂 类别 代表 常用浓度 作用方式 用途及用法 醇类 乙醇 70-75% 抑制细菌使蛋白质凝固变性 皮肤和器皿消毒对芽孢、孢子无效 37~40% 醛类 甲醛 接种室、接种箱熏蒸，杀死空气中微 与蛋白质胺基结合使其变性 2ml/m3 生物 石炭酸 5% 酚类 来苏儿 破坏细胞膜，蛋白质变性 接种室空气及器皿消毒空气及皮肤 2-5% 消毒 重金属离子 升汞 0.1% 细菌细胞酶失活而中毒死亡 植物组织，如根瘤的消毒（有剧毒） 氧化剂 高锰酸钾 0.1-3% 蛋白质及酶氧化变性 水果、皮肤、器皿消毒饮水及粪便消 漂白粉 1-5% 毒 表面活性剂 肥皂新洁尔灭 水稀释20倍 破细胞膜的渗透压 皮肤、手及器皿的消毒 卤素 碘 1%碘酒 蛋白质、酶受破坏 皮肤消毒 染料 结晶紫 2-4%水溶液 抑制细胞壁的合成作用 皮肤创伤消毒 酸类 乳酸 80%乳酸1ml/m3 食醋 与细胞原生质结合 熏蒸消毒空气，可预防流感病毒 3-5mL/m3 碱类 石灰水 3-5%水溶液 破坏酶的活性 地面消毒