医学分子生物学 盛德乔 2021/223
2021/2/23 1 医学分子生物学 盛 德 乔
第十一章核酸的体外护增 2021/223
2021/2/23 2 第十一章 核酸的体外扩增
第一节聚合链式反应 polymerase chain reaction PCR 2021/223
2021/2/23 3 第一节 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR
一、PCR的本原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性90~97℃C 退火45~55℃ 延伸72℃左右 第十一章 2021/2/23
第十一章 2021/2/23 4 一、PCR的基本原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 – 变性 90～97℃ – 退火 45～55℃ – 延伸 72℃左右
口囗)90口95 70口75口 40口60口 第十一章 2021/2/23
第十一章 2021/2/23 5 变变 变变 变变 90变95变 70变75变 40变60变
二、PCR引物设计 对引物,与3端互补 2.长度:15~30个核苷酸 3.碱基分布随机 4.引物内、引物间不应有互补序列 5.引物与非特异扩增区无同源性 6.3端必须互补 第费7.5端可游离 2021/2/23 6
第十一章 2021/2/23 6 二、PCR引物设计 1. 一对引物，与3′端互补 2. 长度：15～30个核苷酸 3. 碱基分布随机 4. 引物内、引物间不应有互补序列 5. 引物与非特异扩增区无同源性 6. 3′端必须互补 7. 5′端可游离
三、模板的制备 DNA 1.从细胞中提取DNA:血细胞、绒毛、尿 样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 2.固定和包埋的组织标本:脱蜡、蛋白酶K 消化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处 第十一章 理 2021/2/23 7
第十一章 2021/2/23 7 三、模板的制备 DNA 1. 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿 样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 2. 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K 消化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处 理
四、PCR的基本反应 (一)、以DNA为模板的反应: 10x缓冲液 10p 4种dNTP混合物各200μmo 引物 各10~100pmol 模板DNA 0.1~2pg Taq dna聚合酶2.5u 加双或三蒸水至10M 2+ 1.5m 第十一章 2021/2/23
第十一章 2021/2/23 8 四、PCR的基本反应 （一）、以DNA为模板的反应： 10×缓冲液 10 l 4种dNTP混合物 各200 mol/L 引物 各10～100 pmol 模板DNA 0.1～2 g Taq DNA聚合酶 2.5 u Mg2+ 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100 l
PCR反应五要素:引物、酶、dNTP、 模板和Mg2+ Tag DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能 第十一章 2021/2/23
第十一章 2021/2/23 9 PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、 模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能
二)、以mRNA为模板的反应 mRNA 5 5× Buffer4ul dNTP 2μl(10mmol/L) RNasin I ul(20u) AMV RTase 1 ul(10u) Oligo(dT)12-1s(或下游引物)1μl ddo 6ul /20μl 第十一章42℃水浴1小时,95℃水浴10分钟灭活逆转 212录酶。向上述反应体系中添加如下试剂:0
第十一章 2021/2/23 10 （二）、以mRNA为模板的反应 mRNA 5 l 5× Buffer 4 l dNTP 2 l(10mmol/L) RNasin 1 l(20u) AMV RTase 1 l(10u) Oligo(dT)12—18(或下游引物) 1 l ddH2O 6l /20 l 42℃水浴1小时，95 ℃水浴10分钟灭活逆转 录酶。向上述反应体系中添加如下试剂：