真核表达体系 转染方法 磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染;人造膜 显微注射 筛选标志 tk- Neor g418 瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染目的基因整合进宿主基因组
真核表达体系 • 转染方法 – 磷酸钙沉淀 – DEAE葡聚糖介导转染 – 电穿孔 – 脂质体转染；人造膜 – 显微注射 • 筛选标志 tk- Neo r G418 • 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 • 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
tk细胞突变祩筛选转染细胞 胸苷激酶(tk) TTP:从头合成(氨甲喋呤阻断),补救合 成 HAT选择(H:次黄嘌呤;A:氨甲喋呤; T:胸苷) tk+:生长 tk+带tk基因的质粒:生长
tk- 细胞突变株筛选转染细胞 • 胸苷激酶（tk） – TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合 成 – HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤； T：胸苷） – tk+：生长 – tk-+带tk基因的质粒：生长
药物筛选转染细胞 neo 新霉素:细菌抗生素,干扰原核生物蛋白质 合成 G418:千扰原核、真核生物 neo:磷酸转移酶,使G418失活 neo与目的基因连锁,转染
药物筛选转染细胞 • neor – 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质 合成 – G418：干扰原核、真核生物 – neo：磷酸转移酶，使G418失活 – neo 与目的基因连锁,转染
收集细胞(离心) 裂解细胞(溶菌酶、匀浆或超声液) 回收包涵体(离心:1001200) 洗涤包涵体(含去污剂的缓冲液) 裂解包涵体及溶解蛋白质(变性剂溶液:尿素或盐酸胍,可含去污剂或巯基试剂) 变性蛋白质的纯化色谱法) 蛋白质复性(缓慢稀释变性剂:透析法或稀释法) 获得得有活性的蛋白质 图617从包涵体中提取活性蛋白质的流程
目的基因的定点诱变及其应用 基因定点诱变技术 基因定点诱变技术的应用 长效胰岛素、快速吸收胰岛素 基因克隆的改建 *碱性成纤维细胞生长因子(bFGH):牛源性→ 人源性,2个核苷酸的差异
目的基因的定点诱变及其应用 • 基因定点诱变技术 • 基因定点诱变技术的应用 – 长效胰岛素、快速吸收胰岛素 – 基因克隆的改建 * 碱性成纤维细胞生长因子（bFGH）：牛源性→ 人源性，2个核苷酸的差异
A TTCT GGATACCCA-5′ 诱变引物 AAGAG CCTATGGGT M13 (Wild Type) TAG ATC am dNTP DN Apol 传代 杂交 复制 TCG AGC W. T 图5-4定点窦变技术建立琥珀型突变体
n M13 M13 M13 甲 丙 图5-5引物设计原则 甲:多点寞变;乙:缺失突变;丙:插入突变
容许宿主 模板 U>T (dut ung 含U模板 RZ1032 甲 乙 A 模板-引物杂交 dNTP 延长 U DNApol 丙 非容许宿主 JM103 容许宿主 RZ1032 1/2 A A 存 死 活 戊 图5-8定点突变的 Kunkel法
原有序列 改建成 TTTGAA~定点突变 TTCGAA一 (不是限制性内切酶切点) ( Hind il切点)
第九章DNA序列测定 末端终止法-待测单链DNA模板引物 四种dNTP(其中一种用2P/5标记)终止剂 ( ddNtP)DNA聚合酶 Sanger发明:两次获得诺贝尔奖 分别得到 dda ddt ddg ddo结尾的片段
第九章 DNA序列测定 • 末端终止法--待测单链DNA 模板 引物 四种dNTP(其中一种用32P/35S标记) 终止剂 (ddNTP) DNA聚合酶 • Sanger发明：两次获得诺贝尔奖 • 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段