SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)测定蛋白质分子量 授课教师:周杰
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量 授课教师：周杰
实验目的 学习 SDS-PAGE测定蛋自质分子量的原 理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 °运用 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染 色鉴定
一 . 实验目的 • 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染 色鉴定
二实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这 种现象称为电泳。 电泳分类:移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液,然后加电场,分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。 °区带电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃 珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜, 现在则多用聚丙烯酰胺(PAGE)和琼脂糖凝胶
二 .实验原理 • 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这 种现象称为电泳。 • 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 • 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。 • 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃 珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶
实验原理 PAG根据其有无浓缩效应,分为连续系统 和不连续系统两大类,连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒 在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH, 凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛 效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳
二. 实验原理 • PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统 和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳
实验原理 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,、是在聚丙烯酰胺凝胶系统中 引进SDS 烷基磺酸钠 SDS能断裂分子内和分 关健,破坏蛋自质的二级和三级结构强还原剂能使 简的二硫键断裂,蛋白质 定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负 电荷的SDS蛋自质复合物,这种 物于结合大量的 SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为悸征的负离子团块,从而降低或消除了备种蛋百 质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋自质分子的迁移 蛋自质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式: Og K-bx,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋百质在相同条 件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量
二. 实验原理 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中 引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量
实验原理 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中,待别 是样品制备过程中蛋质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个: 1)溶液中SDS单体的浓度,当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:14,如果单休浓度降到0.5mmol/L以下 时,两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别,为保证蛋白质与SDS的充 分结合,它们的重量比应该为14或1:3 2)样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低,通常是10~100mmo1/L 3)二硫键是否完全被还原
二. 实验原理 • SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别 是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个： 1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L 3) 二硫键是否完全被还原
实验原理 采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时,只 有完全打开二硫键,蛋白质分子才能被解聚,SDS才能 定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线 性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理, 统基乙醇是一种强还原剂,它使被还原的二硫键不易再氧 ,从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链 (如胰凝乳蛋白酶)组成的,它们在SDS和巯基乙醇作用 下,解离成亚基或单条肽链,因此这一类蛋白质,测定时 只是它们的亚基或单条肽链的MW。 °已发现有些蛋白质不能用 SDS-PAGE测定分子量。如电 荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质(某 一些糖蛋白)以及一些结构蛋白,如胶原蛋自等
二. 实验原理 • 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只 有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能 定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线 性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理， 巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧 化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 • 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链 （如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用 下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时 只是它们的亚基或单条肽链的MW。 • 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电 荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某 些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等
实验原理 采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时, 往往采取2种以上测定方法结合使用。目前其他常用 测定相对分子量的方法有: 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量 (有浓缩样品特点,可分次加样;不需解离亚基,适 宜测定球蛋白,而对纤维蛋白有误差。电泳需2000 伏特小时) 凝胶层析法测定蛋白质相对分子量(特点方法简单 样品用量少,而且有时不需纯物质,一般不引起生物 活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内,线性关 系比较好,但在极端pH时,蛋白质有可能因变性而 偏离。)
二. 实验原理 • 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时， 往往采取2种以上测定方法结合使用。目前其他常用 测定相对分子量的方法有： • 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量 （有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适 宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需2000 伏特小时） • 凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单， 样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物 活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关 系比较好，但在极端pH时，蛋白质有可能因变性而 偏离。）
实验试剂和器材 1材料 低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白:兔磷酸化酶BMW=95 牛血清白蛋白MW=66 兔肌动蛋白MW=4300U 牛碳酸酐酶MW=31000 胰蛋白酶抑制剂MW=20100 鸡蛋清溶菌酶MW=14400 开封后溶于200μ蒸馏水,置-20℃C保存,使用前室温融 化,沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1:称3mg样品1,加2ml蒸馏水溶解
三. 实验试剂和器材 1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融 化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
2实验试剂 (①)30%丙烯酰胺(Acr):称Acr30g,甲叉双丙烯酰胺 (Bis)08g,加蒸馏水至100m,过滤后置棕色瓶中, 4C贮存可用12月。 (②)10%SDS(十二烷基磺酸钠) (3)15mo/LpH88 Tris-Hc缓冲液:称取Trs182g, 加入50m水,用1mo/L盐酸调pH88,最后用蒸馏 水定容至100ml (4)10mo/LpH68Tris-HCl缓冲液:称取Trs121g,加 入50m水,用1mo/L盐酸调pH68,最后用蒸馏水 定容至100m。 (5)0.05mo/LpH8 OTris-HC缓冲液:称取Trs06g,加 入50ml水,用1mo/L盐酸调pH80,最后用蒸馏水定 容至100ml
2.实验试剂 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml