DNA的变性与复性
DNA的变性与复性
本节学习重点 ·DNA变性曲线，包括增色效应、减色效应 、Tm及其影响因素 ·DNA复性曲线，包括影响复性的诸多因素 和Cot2
本节学习重点 • DNA变性曲线，包括增色效应、减色效应 、 Tm及其影响因素 • DNA复性曲线，包括影响复性的诸多因素 和 C0 t(1/2)
一、DNA分子的变性 l、变性(denaturation或融解melting): DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开 变成单链，这一链分离的过程叫做变性。 条件：加热，高pH,有机溶剂（尿素、酰胺），低盐浓度等
一、DNA分子的变性 1、变性（denaturation 或 融解 melting）： DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开 变成单链，这一链分离的过程叫做变性。 条件：加热，高pH，有机溶剂（尿素、 酰胺 )，低盐浓度等
※熔液黏度降低 ※沉降速度加大 ※浮力密度上升 ※此外吸收值升高（A260nm),即增色效应 指在DNA变性的过程中，它在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升。 单一核苷酸的光吸收值最大，其实是单链DNA或RNA,双 链DNA最小，这是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的。 即双链DNA相对于单链DNA是减色的(hypochromic),反 之单链DNA相对于双链DNA是增色的(hyperchromic)
※ 熔液黏度降低 ※ 沉降速度加大 ※ 浮力密度上升 ※ 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，它在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升。 单一核苷酸的光吸收值最大，其实是单链DNA 或RNA，双 链DNA最小，这是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的。 即双链DNA相对于单链DNA是减色的（hypochromic），反 之单链DNA相对于双链DNA是增色的（hyperchromic）
熔解曲线与Tm值 OD 1.37 1.185 1.0 ℃ Tm=℃ofC=C/2 =OD增加值的中点温度 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 Tm是DNA的(G+C)含量的函数
1.185 1.0 1.37 OD ℃ Tm = ℃ of Ct = C0 /2 = OD增加值的中点温度 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 Tm是DNA的（G+C）含量的函数。 熔解曲线与Tm值
影响Tm的因素有哪些？
影响Tm 的因素有哪些？
GC含量 。氵 溶液中的离子强度 ·为什么DNA溶液中的离子强度越高，Tm 也就越高？
• GC含量 • 溶液中的离子强度 • 为什么DNA溶液中的离子强度越高， Tm 也就越高？
·核酸在260nm处的光吸收可用于测定其浓 度。当浓度为1mgml、光程为1cm时，双 链DNA的A26O=20,RNA和单链DNA的 A260=25。 OD260/OD280可用于测定DNA纯度。 OD260/OD280=1.8为纯dsDNA,纯RNA 为2.0，蛋白小于1（一般是0.5）
• 核酸在260nm处的光吸收可用于测定其浓 度。当浓度为1mg/ml、光程为1cm时，双 链DNA 的A260=20，RNA和单链DNA的 A260=25。 • OD260/OD280可用于测定DNA纯度。 OD260/OD280 =1.8为纯dsDNA， 纯RNA 为2.0，蛋白小于1（一般是0.5）
2、常用的变性方法 ☆热变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 ☆碱变性 pH=11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 ©保存单链DNA的条件保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L
2、 常用的变性方法 ☆ 热变性 ☆ 碱变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 pH＝11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 ◎ 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L
二、DNA分子的复性(anneal or renaturation) 概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火) Denaturation D.S DNA S.S DNA Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 复性DNA分子不一定是原有的一对互补链
D.S DNA S.S DNA Denaturation ▲ ▼ Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation） 概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火） ❖复性DNA分子不一定是原有的一对互补链