园艺植物组织培养实验指导 甘肃农业大学农学院 园艺植物组织培养实验指导 陈佰鸿主编 农学院果树科学系 2011年8月
园艺植物组织培养实验指导 前言 《园艺植物组织培养实验指导》是根据园艺植物组织培养实践教学要求编写的。园 艺植物组培课程的实践教学部分是要使学生在有一定的理性认识基础上，进行感性教学， 使课程知识真正成为学生所掌握的一门学科技术，运用于生产工作中。通过实训教学， 要求学生能比较熟练的进行组培中的培养基的设计和配制，植物材料的选择的灭菌，接 种操作，能掌握初代、继代和生根培养中的各种技术问题，并具有一定的研究能力，可 独立进行一般植物培养的全过程，并对出现的问题能进行科学的分析，提出有效的预防 和补救措施
园艺植物组织培养实验指导 学生实验守则 1、学生应按教学计划与课程安排进入实验室做实验，严格遵守实验室的规章制度及管 理措施，执行实验纪律。 2、服从教师及有关实验技术人员的指导，实验前要认真预习，明确实验目的、要求、方 法和步骤，认真按照要求进行操作，不得在实验室内做与本实验无关的事情。 3、实验中不准动用与本实验无关的仪器设备，不得动用它组的仪器、工具、文件、材料。 实验时，按教师规定做好实验的准备工作（如接线、安装等），经指导教师检查同意后， 方可开始做实验。违反操作规程造成仪器设备及实验材料损坏者，将酌情赔偿，并视 情节轻重进行批评直到纪律处分。 4、严格遵守仪器设备的操作规程，设备发生故障应立即停止实验，报指导教师和实验员 处理，不得擅自拆卸。 5、进入实验室内必须保持肃静、整洁。 6、实验过程中，要严肃认真，详细记录实验数据和结果，经指导教师签字认可后，方可 结束实验。实验后要按时做好实验报告，交指导教师批阅，数据和报告要求实事求是， 不得抄袭、伪造和涂改，否则按不及格处理。 7、认真搞好实验室的清洁卫生。每次实验结束，要依照实验室的有关规定以及指导教师 的要求做好实验的结束工作，并经教师许可后方可离开
园艺植物组织培养实验指导 实验报告的基本内容和要求 实验报告虽是以实验数据的准确性和可靠性为依据，但将实验数据整理成一份好的 报告，需要经过严格训练。 实验报告的基本内容应包括以下几个方面： (1)实验目的 (2)实验内容 (3)实验所依据的原理 (4)所用的实验材料和仪器 (5)实验方法及操作步骤 (6)实验数据及数据整理的结果 (7)根据实验结果，得出哪些有价值的结论，并对某些问题进行讨论 进
园艺植物组织培养实验指导 目 录 实验一MS培养基母液的配制 实验二MS固体培养基的配制与灭菌 实验三外植体的消毒与无菌操作 7 实验四 甜瓜叶片不定芽诱导… 9 实验五植物茎尖的剥离与培养 ..11 实验六胚培养.……13 实验七、试管苗继代与生根培养 .15 实验八再生植株的驯化移栽..17 实验九果树试管苗气孔的观察与气孔密度和孔口总面积的测定19
园艺植物组织培养实验指导 实验一MS培养基母液的配制 一、实验目的 了解MS培养基母液的组分，掌握培养基母液配制的基本原则。 二、实验内容 根据MS培养基配方，配制MS培养基母液，大量元素母液配成20X,CCl22H0母液100X, 微量元素母液100X,铁盐母液100X,有机成分母液100X(详见附表1)，并将配好的母液依次贴好标 签，保存于4℃冰箱。 三、实验原理 由于培养基成分较多，并且有些成分用量甚微，如果每配制一次即进行多次称，不仅会造成较 大的误差，而且会增加工作量，因而在配制培养基时，为了提高各种药品称量的准确性和取用方便， 通常先根据各组分性质，配制成较浓的母液（母液浓度为培养基浓度的若干倍如20或100倍），配 制培养基时根据用量量取。 四、试剂及器具 试剂：药品按MS培养基配方准备：激素按需要准备；蒸馏水；1mol/L盐酸：1mol/L NaOH。 器具：1/100、1/10000电子天平；冰箱：烧杯：量筒：容量瓶：磁力搅拌器：试剂瓶：标签 纸等。 五、方法和步骤 (一)大量元素母液（母液I) 因大量元素用量大，为避免过高浓度的混合液会发生沉淀，一般配成20倍的母液。配制时先加 入4/5体积的灭过菌的蒸馏水，按表1中化合物出现顺序，依次在1/100的电子天平上称量KNO,. NH4NO3、MgSO47HO、KHPO4后溶解。必须在各药品充分溶解后加入另一种，最后加蒸馏水定 容至1L,即为20X的大量元素母液，贴上标签注明母液名称、倍数（或浓度）、日期，置于普通冰箱 (4℃)贮存。配一升MS培养基，取大量元素母液50ml。CaC122H20经常将单独配制保存。 (二)微量元素（母液II) 微量元素因用量小，为称量方便及精确，常配成100倍的母液，用1/10000电子天平依次称量 MnSO44H20、ZnSO47H20、H3BO3、KI以及Na2MoO42H20,其余同母液I的方法。而CuSO45HO 和CoCl26H20单独配成2000X的保存，配母液时抽取20ml。配1升MS培养基，取微量元素母液 10mle (三)铁盐（母液III) 铁盐为FeS047H,0,由于在使用过程中容易产生F©(OD3沉淀，一般先将其配成螯合物。常配 成100倍母液。称取FeS04·7Hz0,Na2-EDTA,分别加热溶解，待其充分溶解后混合、其余同母液I
园艺植物组织培养实验指导 的方法。配成的铁盐母液呈黄色。每配制1升MS培养基，取铁盐母液用10ml。 (四)有机成分（母液IV) 主要指氨基酸及维生素类物质，将各种有机物质配成混合的100倍母液。分别溶解后混合，定 容。配一升MS培养基，取母液10ml。 (五)植物激素 各种激素母液所需浓度一般为0.2~lg/ml,单独保，配制培养基时根据不同的配方要求分别 加入。 1)IAA、BA、GA3先溶与少量95%酒精，再加水定容到一定浓度。 2)NAA可溶于热水或少量95%的酒精中，再加水定溶到一定浓度。 3)2,4一D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。 4)KN和BA先溶于少量1mol的HCI中，再加水定容。 5)玉米素先溶于少量95%酒精中，再加水至一定浓度。 六、作业 1、为什么要配置母液？在母液的配制、贮存及使用中应注意哪些问题？ 2
园艺植物组织培养实验指导 附表1MS培养基母液的配方 培养基配方用量 每升母液用量 母液扩大倍用量(ml)升培养基 成分 (mg） (mg) 数 大量元素母液（母液） KNO3 1900 38000 NHaNO3 1650 3300 20 50 MgSO47H2O 370 7400 KH2PO4 170 3400 CaClz2H20 440 44000 100 10 微量元素（母液） MnSO44H2O 22.3 2230 ZnSO47H2O 8.6 860 H3BO3 6.2 920 KI 0.83 83 100 10 Na2MoO42H2O 0.25 25 CuSO45H2O 0.025 2.5 CoCl26H2O 0.025 2.5 铁盐（母液Ⅲ） FeSO7H2O 27.85 2785 100 10 NazEDTA-2H2O 37.25 3725 有机成分（母液V) 甘氨酸 2 200 盐酸硫氨素 0.4 40 盐酸吡哆素 0.5 50 100 10 烟酸 0.5 50 肌醇 100 10000 注：CaC122H20单独配制保存。 CuSO45H20和CoC126H20单独配成2000X的保存，配母液时稀释。 3
园艺植物组织培养实验指导 实验二 MS固体培养基的配制与灭菌 一、实验目的 学习用母液法配制MS固体培养基，掌握培养基灭菌的方法及操作过程。 二、实验内容 根据已配好MS培养基母液，配制1升MS固体培养基，首先在准备好的烧杯中加入800mL 蒸馏水，依次抽取20X大量元素母液50mL;100 X CaCl22H0母液5mL;100X微量元素母液5mL: 100X铁盐母液5mL:100X有机成分母液5mL。用1mol/L NaOH调pH值在5.8-6.2之间，加入5g 琼脂，微波加热致沸腾，并保持3-5min后分装在20个三角瓶中，高压灭菌20nmin后待其自然冷却后 准备接种。 三、实验原理 培养基是将植物细胞或组织生长所需要的各种营养物质，用人工方法配制成的一种营养基质。 除含有水份、碳水化合物、无机盐外，还有各种必要的维生素、有机附加物及生长调节物质，并根 据植物细胞或组织生长的需要，将培养基的pH值调节在一定范围内。按照是否在培养基中加入琼脂 等凝固剂，培养基又分为固体培养基和液体培养基。由于不同的植物细胞或组织营养要求不同，人 们设计了各种培养基。常用的基本培养基有MS培养基(Murashige and Skoog,l962),B5培养基 (Gamborgetal,1968),N6培养基(Chuetal,1974)等。 培养基含有的各种营养物质，对细菌和霉菌等微生物来说也是很好的营养物质。微生物在培养 基中往往比植物细胞生长更为迅速，并且产生毒素，可致植物细胞死亡。因此，为防微生物污染， 培养基配制好后需及时进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。 四、仪器和药品 药品：蔗糖、琼脂、1mol/LHCl、1mol/LNaOH,MS培养基的母液，植物生长调节物质母液。 仪器：电子天平、磁力搅拌器、烧杯(50ml,100ml,500ml,1000ml)、量筒(1000ml,500ml, 25ml)、药勺、称量纸、玻璃棒、移液管或移液枪、微波炉、吸耳球、酸度计、三角瓶(50ml,100ml)、 耐高温高压的封口膜、高压灭菌锅。 五、方法和步骤 (一)MS固体培养基的配制 1、将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等 放在指定的位置；准备好蒸馏水及封口塑料薄膜等。 根据MS培养基配方，各种母液的浓度及要求配制的总量，计算好需各种母液的量。取1000l 烧杯一只，加入800ml水，用量筒和移液枪依次抽取20X大量元素母液50mL:100XCaC122H0母 液5mL;100X微量元素母液5mL;100X铁盐母液5mL;100X有机成分母液5mL,磁力搅拌器混 匀
园艺植物组织培养实验指导 2、加入30g蔗糖，磁力搅拌器溶解后，用1mol/LNaOH(或KOH或0.lmol/LHC1将pH调整5.8 并定容至1000ml。 3、按需要加入植物激素（浓度临时确定）。 4、加入5g琼脂粉，微波加热至沸腾，并保持3-5mine 5、按50mL每瓶分装培养基，并封口。 (二)培养基的灭菌 培养基灭菌的方法有多种，但以高压蒸汽灭菌法最为常用。其具体操作方法是： 1、打开灭菌锅盖，向外层锅内加水到与锅底的支架平齐。 2、将待灭菌的培养基、蒸馏水、滤纸等其它物品放入灭菌锅筒内，最好装完后，在上面放几层 牛皮纸或纱布、毛巾等，防止水蒸汽从锅顶冷凝滴下打湿包头纸。然后盖好锅盖，按相对方向拧紧 螺旋，使锅密闭。 3、高压灭菌锅的放气、加压，为使锅内物体均匀升温，排净冷空气，使压力和温度的关系相对 应，保证灭菌彻底，放气、加压有几种方法，可任选一种。 ①打开放气阀（安全阀总是关闭的）自开始产生蒸汽后约8min再关紧放气阀。 ②打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出再关闭。 ③先关闭放气阀，待压力上升到0.5kg/cm2,打开放气阀放出空气，再关闭。 待压力上升到1.1~1.2kg/cm2,温度为121℃时，调小火力使其维持20min。 4、切断热源，并缓慢放出蒸汽，待压力降至零时，才能打开盖子，取出灭菌物品。 5、刚灭过菌的培养基应在室温下放置2~3天后，观察有无菌类生长，以确定培养基是否彻底灭 菌。经检查没有杂菌生长污染，方可使用。 注意事项：1灭菌锅内冷空气必需排尽，否则，压力表指针虽达到了一定压力，但由于锅内冷空气的 存在并达不到对应的温度，从而影响灭菌效果。 2.在灭菌过程中，当压力达到时，要严格控制时间，时间太长会使培养基中的一些化学物 质遭到破坏，影响培养基的成分；而时间太短则达不到灭菌效果。由于容器的体积不同，瓶壁的厚 度不同，所以灭菌的时间应适当考虑，对高压灭菌后不会变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种 用具等可延长灭菌时间或提高灭菌压力，而对培养基灭菌既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中成 份变质或效力降低，因此必须严格遵守时间。随容器大小而变化的培养基灭菌时间，可以参考表2 一1，但还要考虑锅内总物品的多少。如果容器大，但数量很少，仍可减少时间。 3.在切断热源，放气时应注意，不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中 的液体四溢，培养基沾污瓶塞、瓶口等造成今后污染。一定注意，待气压降至0时，才能开盖，否 则危险。 5