2017/9/12 第三章细胞生物学的研究方法 样品准备 图像分析 显微镜拍 定量和统计分析 本章概要 1,显微镜技术； 2.X射线衍射技术； 3.流式显微荧光技术 4放射自显影技术 5.蛋白质亚细胞定位技术；6.双分子互作重速技术： 7.荧光共振能量转移技术；8.原位杂交技术； 9.分子细胞生物学方法： 10.细胞培养和细胞杂交技术 11.基因转移技术。 学习重点： 1、業握各种显徽镜术的原理及适用范围。 2、了解各种分子细胞学方法和基因转移技术。 1
2017/9/12 1 第三章 细胞生物学的研究方法 1 西北农林科技大学生命科学学院-细胞生物学教研室 本章概要： 1.显微镜技术； 2.X射线衍射技术； 3.流式显微荧光技术； 4.放射自显影技术； 5.蛋白质亚细胞定位技术； 6.双分子互作重建技术； 7.荧光共振能量转移技术； 8.原位杂交技术； 9.分子细胞生物学方法； 10.细胞培养和细胞杂交技术； 11.基因转移技术。 学习重点： 1、掌握各种显微镜术的原理及适用范围。 2、了解各种分子细胞学方法和基因转移技术
2017/9/12 第一节细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜 几种显微镜可观察的样品大小 (箭头之间的范围)及其分辨 能力（右侧箭头所指位置 1 cm 1 mm 100 um 10 um 1 um 100 om 10 nm 1 nm 0.1 nm ,光学显微镜 —电子显领轴 —扫能道显镜一—— ·分辨率：能区分开两个质点间的最小距离 ‘0m镜和电子显薇镜的分辨率分别为：02mm 2
2017/9/12 2 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜 3 几种显微镜可观察的样品大小 （箭头之间的范围）及其分辨 能力（右侧箭头所指位置 4 • 分辨率：能区分开两个质点间的最小距离 • 眼睛、光学显微镜和电子显微镜的分辨率分别为：0.2mm、 0.2μm和0.2nm
2017/9/12 一、光学显微镜 (一)、普通复式光学显微镜 (二)、相差显微镜和微分干涉显微镜 (三)、荧光显微镜 (四)、激光扫描共焦显微镜 普通光学显数铺 光共聚焦扫描显微 CH30CX40生物相差登镜 3 3
2017/9/12 3 一、光学显微镜 （一）、普通复式光学显微镜 （二）、相差显微镜和微分干涉显微镜 （三）、荧光显微镜 （四）、激光扫描共焦显微镜 5 普通光学显微镜 荧光显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦扫描显微镜 6
2017/9/12 通光学成示童国 决定光学显微镜的分辨率的要素： 显微镜的分辨率：显徽镜的分辨率就是显微镜能看到的最小的东西， 公舞率的大钠被熊的处裤力来决定的：物镜的分辨力又是由它的数值孔 可人淀分所 晋是光学被核德明夜9m军720而瓷中的数值孔径大小最高等于1。 D 0.61 N.sin(a/2) yD:分辨率 入：入射光的波长 所介质的折射率(1或1.5) √ā：物镜的镜口角
2017/9/12 4 （一）、普通（复式）光学显微镜 • 结构：1）光学放大系统。2）照明系统。3）机械和支架系统。 普通光学显微镜成像示意图 7 决定光学显微镜的分辨率的要素： • 显微镜的分辨率：显微镜的分辨率就是显微镜能看到的最小的东西。 • 分辨率的大小由物镜的分辨力来决定的；物镜的分辨力又是由它的数值孔 径和照明光线的波长决定的. • 不同的显微镜的分辨率有所不同，最小分辨距离=0.61λ/NA，最小分辨距 离越小，分辨率越高，提高物镜的数值孔径NA，或者缩短光的波长λ，都 可以提高分辨率 D: 分辨率 ； • 可见光的波长范围在390nm-670nm，而空气中的数值孔径大小最高等于1， 普通光学显微镜的极限分辨率是200nm左右。 sin( / 2) 0.61 N D 8 D: 分辨率 λ：入射光的波长 N：介质的折射率（1或1.5） α：物镜的镜口角 介质 空气 水 香柏油 α溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66
2017/9/12 光学显微镜样品制备技术 石蜡切片的制备程序 取材→圆定包埋一初片染色十观察 y7 (二)、相差显微镜(phase contrast microscope) 的振幅差显微镜（将相位差转变成振幅差（明暗差）的显徽镜)，提高了密度不 同物质图像的明暗区别，可用于观察未经染色的细胞结构。 梁换卖射的光（视野中背景光）与经物体行射的光分开：②将大约一半的波长从相位 晨装程结醒告竿反能留战告喜 光落 5
2017/9/12 5 石蜡切片的制备程序 光学显微镜样品制备技术 9 （二)、相差显微镜（phase contrast microscope） • 相差显微镜:利用光干涉现象将透过标本的光线光程差或相位差转换成肉眼可分辨 的振幅差显微镜（将相位差转变成振幅差（明暗差）的显微镜）。提高了密度不 同物质图像的明暗区别，可用于观察未经染色的细胞结构。 • ①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位 中除去。 • 1）环形光阑:产生同相位光束 产生同相位光束。 • 2）相位板：将直射光推迟1/4λ或将折射光推迟1/4λ • 3）合轴调节望远镜：使两束光重合产生干涉。 相差显微镜对比度的产生：反射光和散射光比非直射光落后1/2 10 波长在光路重合后干涉抵消，使切片图象比背景暗
2017/9/12 两种不同类型的光学显徽镜所拍摄的图像比较 相差显微镜下的细胞 ● 体外培养的MDCK细胞的图像 11 〈微公于法显微捷区相显株、 到用馆振 前爽强对清式晶体棱镜分束偏提方向西车的两束光。不产生干涉。 需鼗露盗香星笑精鑫销姿鼻2涂橙惠合：发生干法，振幅 12 6
2017/9/12 6 相差显微镜下的细胞 两种不同类型的光学显微镜所拍摄的图像比较 硅藻：左，相差；右明场。 11 硅藻：左，相差；右明场。 http://www.gpmatthews.nildram.co.uk 酵母 体外培养的MDCK细胞的图像 • A: 普通显微镜所拍 • B：相差显微镜所拍 • 一种将样品厚度上的微小区别转化成明暗区别相差显微镜。 • 利用偏振光。 • 单束偏振光通过晶体棱镜分成偏振方向垂直的两束光。不产生干涉。 • 两束光通过标本薄厚、密度不同区域时产生相位差。 • 两束光再次通过晶体棱镜使偏振方向相同光路重合，发生干涉，振幅 消弱或增强 产生不同区域明暗差异的立体感 （二）、微分干涉显微镜 ， 。 培养的成纤维细胞的四种不同显微图像： 12 (A) 明场。(B) 相差。(C) 微分干涉。(D) 暗场（暗视野）。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2017/9/12 )1 (三)、荧光显微镜(fluorescence microscope) ·荧光：分子由激发态回到基态时，由于电子跃迁而由被 激发分子发射的光。 ·特点：荧光比激发光波长长。单物质分子荧光波长单一 ·自发荧光和次生荧光。 7
2017/9/12 7 一种团藻属淡水绿藻 ， 可 球状的多细胞群落。此 绿 落图像类似别样的向日 葵 德 ·温瑟利用微分干涉反 差 的 。 戈德 虱性车轮虫 ·古恩斯，微分干涉 相 经计算机图象处理，光学显微镜甚 至可以看到活细胞中的微管 （微分 可形成空的 、 绿藻及其子群 葵，是由吉差显微镜拍摄 相 衬 13 至可以看到活细胞中的微管 （微分 干涉相差显微镜）：(A) 显示微分 干涉相差显微镜获取未处理数字图 像中未染色的微管。 (B) 此时图像 经数字处理对比度提高。 注意微管 的动态变化 ，有些微管在两幅先后 获取的图像中已改变了长度和位置。 (Viki Allan. http://www.ncbi.nlm.nih.gov) （三）、荧光显微镜（fluorescence microscope） • 荧光：分子由激发态回到基态时，由于电子跃迁而由被 激发分子发射的光。 • 特点：荧光比激发光波长长。单物质分子荧光 单物质分子荧光波长单一。 • 自发荧光和次生荧光。 14
2017/9/12 ·细胞组分荧光观赛 ·自发荧光：叶绿体（叶绿素）， 细胞壁（木质素）· ,次生荧光： 1)荧光染料直这 刀醛费境：使统光未共价结合在特异蛋白质上洗入细胞，管，发 3》免疫炎尖标记用茨光表标记的抗体染持异街响质第抗物质台贺觉篇夏 基因碳行 8
2017/9/12 8 • 细胞组分荧光观察 • 自发荧光：叶绿体（叶绿素），细胞壁（木质素）。 • 次生荧光： 1）荧光染料直染：吖啶橙(DNA、RNA)，DAPI(核、DNA，蓝)，PI(核、DNA， 红)，羰花青染料(脂类、细胞膜)，荧光素（细胞壁），Fluo-3(Ca2+）等。 2）荧光素直接标记 荧光素直接标记：使荧光素共价结合在特异蛋白质上注入细胞 使荧光素共价结合在特异蛋白质上注入细胞。微管、微 丝蛋白荧光标记。 3）免疫荧光标记：用荧光素标记的抗体染特异蛋白质等抗原物质。如微管蛋 白抗体荧光标记，细胞核酸原位杂交中抗生物素（地高辛）蛋白荧光标记。 4）荧光蛋白标记技术：绿色荧光蛋白基因与特异蛋白基因融合在细胞内表达 荧光蛋白标记的特异蛋白，可以检测、跟踪特异蛋白。 15 间接免疫细胞化学 下图：表达绿色荧光蛋白和 红色荧光蛋白的苜蓿中华根 瘤菌Sinorhizobium meliloti吸 附至转基因蒺藜苜蓿 Medicago truncatula （表达 绿色荧光蛋白::踝蛋白融合 蛋白，其标记微丝构成的细 胞骨架 ）的根毛上，注意 根毛受细菌结瘤因子（一种 脂几丁寡糖）的影响已显示 老鼠的成纤维细胞 ， 荧 微管呈绿色 、微丝 红 脂几丁寡糖）的影响已显示 畸形, 结瘤因子在转录激活 因子Nod D（一种蛋白转录 因子，受类黄酮调控）调控 下合成。 (Dan Gage, http://jb.asm.org) 荧 光 /芭芭拉 左图：蝾 螈 不同结构 ） 红 色 、 核蓝色 16 螈肺细胞的有丝分裂 （ 5个 ,荧光 /阿列克谢
2017/9/12 绿色英光白来自这水水 话去皮车细粘税表 镜光验金装有出雀支7 (四)、激光扫描共聚焦显微镜 (Laser scanning confocal microscope) ·用聚焦极好的激光束对样品单一景 深的层面进行快速扫描，从而获得 “光学切片”效果的显微镜。 共编小 双色1 ·在传统光学显微镜基础上，LSCM用 激光作为光源，采用共轭聚焦原理 和装置，并利用计算机对所观察的 对象进行数字图像处理观察、分析 和输出。 其特点是可以对样品进行断层扫描 焦点 和成像，进行无损伤观察和分析细 胞的三维空间结构。 9
2017/9/12 9 绿色荧光蛋白来自这种水晶水母 上图：洋葱表皮细胞在细胞质及核质中瞬时表达 绿色荧光蛋白(smGFP) 。细胞用基因枪转化。 左图：日本大阪大学的科研人员培育出能够夜 17 里发光的含有绿色荧光蛋白的老鼠 （四）、激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocal microscope） • 用聚焦极好的激光束对样品单一景 深的层面进行快速扫描，从而获得 “光学切片”效果的显微镜。 • 在传统光学显微镜基础上，LSCM用 激光作为光源，采用共轭聚焦原理 和装置，并利用计算机对所观察的 对象进行数字图像处理观察、分析 和输出 18 。 • 其特点是可以对样品进行断层扫描 和成像，进行无损伤观察和分析细 胞的三维空间结构
2017/9/12 装空出 19 荧光显微镜(A)和激光扫描共焦显微镜(B) 所观察图像的比较 0 10
2017/9/12 10 激光共聚焦显微图（左） 细胞表达 （成纤维细胞生长因子受体 融合蛋白 绿色）和 19 激光共聚焦显微图（左）：Cos-7细胞表达Fgfr3-GFP（成纤维细胞生长因子受体3－GFP融合蛋白，绿色）和 cCbl－DsRed融合蛋白（c-Cbl是一种使呈红色） 。 Fgfr3-GFP处于细胞中央区域的小囊泡上。 c-Cbl-DsRed则广泛 的分布在整个细胞中，特别是分布在清晰但未知的胞质结构中 。 Fgfr3－GFP和 c-Cb－DsRed几乎没有共同定位 区域。 激光共聚焦显微图显示特异蛋白在细胞中的位置（右） ：Cos-7 细胞表达 Fgfr3-GFP 融合蛋白（绿色）且细胞用 LysoTracker-Red 染色(LysoTracker-Red是溶酶体红色荧光探针，染料进入细胞后定位在溶酶体上，呈红色), 两者 均处在圆形囊泡中，黄色荧光显示Fgfr3-GFP定位于溶酶体上（绿色和红色荧光叠加）。 荧光显微镜（A）和激光扫描共焦显微镜（B） 所观察图像的比较 20