第十六章基因诊断技术及其应用 基因诊断是利用DNA分子杂交等分子生物学技 术,直接探查人体基因组DNA存在的缺陷或是基 因表达产物的异常,从而对人体状态和疾病作出诊 断。基因诊断也称DNA诊断或DNA探针技术或基 因探针技术,是20世纪70年代末迅速发展起来的 项应用技术。 快速灵敏、准确可靠的现代分子生物学技术是 基因诊断的先决条件
第十六章 基因诊断技术及其应用 基因诊断是利用DNA分子杂交等分子生物学技 术，直接探查人体基因组DNA存在的缺陷或是基 因表达产物的异常，从而对人体状态和疾病作出诊 断。基因诊断也称DNA诊断或DNA探针技术或基 因探针技术，是20世纪70年代末迅速发展起来的一 项应用技术。 快速灵敏、准确可靠的现代分子生物学技术是 基因诊断的先决条件
第一节基因诊断的策略 第二节基因诊断的常用技术方法 第主节基因诊断的应用
•第一节 基因诊断的策略 •第二节 基因诊断的常用技术方法 •第三节 基因诊断的应用
第一节基因诊断的策略 基因突变的检测 当致病基因已和分子机制均确知时,直接检测和 分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法。 基因突变检测法可检测基因犬片段缺失和插入 小片段缺失和插入、点突变(只有一种类型的点突 变,或像N-ras突变那样,突变类型很多但只有 两种占优势,或发生在限制酶识别位点上使酶切位 点消失,或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加、异 常基因重排和异常基因融合等的检测。较大片段用 Southern印迹法或PCR法。单个外显子突变采用双
第一节 基因诊断的策略 一、基因突变的检测 当致病基因已和分子机制均确知时，直接检测和 分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法。 基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入、 小片段缺失和插入、点突变(只有一种类型的点突 变，或像N-ras突变那样，突变类型很多但只有一 两种占优势，或发生在限制酶识别位点上使酶切位 点消失，或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加、异 常基因重排和异常基因融合等的检测。较大片段用 Southern印迹法或PCR法。单个外显子突变采用双
引物PCR法,多个外显子突变采用 multiplexor进 电泳条带分析,单个突变点采用 PCR-SSCP法。 测mRNA用 RT-PCR法。 二、基因连锁分析 由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相 互存在连锁关系,在只知致病基因在染色体上的大 概位置而不知确切位置的情况下,只要鉴定与致病 基因相连锁的有关基因的存在与否,就可以判断受 检者是否带有致病基因。常采用限制性片段长度多 态性(RFLP)遗传标志进行多态性分析
引物PCR法，多个外显子突变采用multiplexPCR进 行电泳条带分析，单个突变点采用PCR-SSCP法。 测mRNA用RT-PCR法。 二、基因连锁分析 由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相 互存在连锁关系，在只知致病基因在染色体上的大 概位置而不知确切位置的情况下，只要鉴定与致病 基因相连锁的有关基因的存在与否，就可以判断受 检者是否带有致病基因。常采用限制性片段长度多 态性（RFLP）遗传标志进行多态性分析
感染性疾病外源基因的检测 这类检测一般根据已知病原生物基因组外源 DNA或RNA顺序,采用PCR或 RT-PCR的方法就 可以进行快速、简便而准确的诊断。因此,这类 疾病的基因诊断应用性极强,在严格掌握质控的 前提下,可在临床广泛运用。 四、基因异常表达的检测 用mRNA作标本,采用RT-PCR法进行半定量和 定量分析判断基因表达异常
三、感染性疾病外源基因的检测 这类检测一般根据已知病原生物基因组外源 DNA或RNA顺序，采用PCR或RT-PCR的方法就 可以进行快速、简便而准确的诊断。因此，这类 疾病的基因诊断应用性极强，在严格掌握质控的 前提下，可在临床广泛运用。 四、基因异常表达的检测 用mRNA作标本，采用RT-PCR法进行半定量和 定量分析判断基因表达异常
第二节基因诊断的常用技术方法 核酸分子杂交技术 ()限制性内切酶酶谱分析法图161) MstⅡ酶切位点( CCTNAGO) 正常基因 0.2kb 突变基因 1.35kb 1一正常人;2一突变携带者;3—患者 图16-1镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
第二节 基因诊断的常用技术方法 一、核酸分子杂交技术 ㈠ 限制性内切酶酶谱分析法(图16-1)
此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针 来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发 生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变, 其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多 少)在电泳迁移率上也会随之改变,借此可作出分 析诊断。 (DNA限制性片段长度多态性 (restriction fragnent| ength polymor- phism,RFLP)分析 在人类基因组中,平均约200对碱基可发生一对 变异(称为中性突变),中性突变导致个体间核苷酸 序列的差异,称为DNA多态性。不少DNA多态性 发生在限制性内切酶识别位点上,酶解该DNA片 段就会产生长度不同的片段,称为限制性片段长 度多态性
此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针 来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发 生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变， 其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多 少)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分 析诊断。 ㈡ DNA 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (restriction fragnent length polymor- phism, RFLP)分析 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对 变异(称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸 序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性 发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片 段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长 度多态性
等位基因特异寡核苷酸探针( allele specific oligonucleotide,ASO杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列,人工合 成两种寡核苷酸探针,一种是相应于突变基因碱 基序列的寡核苷酸M,一种是相应于正常基因碱 基序列的寡核苷酸N),用它们分别与受检者DNA 进行分子杂交
㈢ 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO)杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合 成两种寡核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱 基序列的寡核苷酸(M)，一种是相应于正常基因碱 基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA 进行分子杂交
聚合酶链反应(PCR)(图16-2) 根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物 经PCR反应将目的基因片段扩增出来,即可进 步分析判断致病基因的存在与否,并了解其变异 的形式。 图16-2 Leber病患者PCR/SSCP分析 1—正常人;2—纯合突变;3—杂合突变
二、聚合酶链反应(PCR) (图16-2) 根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物， 经PCR反应将目的基因片段扩增出来，即可进一 步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异 的形式
、基因测序 分离出患者的有关基因,测定出其碱基排列 顺序,找出其变异所在,这是最为确切的基因诊 断方法
三、基因测序 分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列 顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊 断方法