第十六章基因诊断技术及其应用 基因诊断是利用DNA分子杂交等分子生物学技 术,直接探查人体基因组DNA存在的缺陷或是基 因表达产物的异常,从而对人体状态和疾病作出诊 断。基因诊断也称DNA诊断或DNA探针技术或基 因探针技术,是20世纪70年代末迅速发展起来的 项应用技术。 快速灵敏、准确可靠的现代分子生物学技术是 基因诊断的先决条件
第十六章 基因诊断技术及其应用 基因诊断是利用DNA分子杂交等分子生物学技 术,直接探查人体基因组DNA存在的缺陷或是基 因表达产物的异常,从而对人体状态和疾病作出诊 断。基因诊断也称DNA诊断或DNA探针技术或基 因探针技术,是20世纪70年代末迅速发展起来的一 项应用技术。 快速灵敏、准确可靠的现代分子生物学技术是 基因诊断的先决条件
第一节基因诊断的策略 基因突变的检测 当致病基因已和分子机制均确知时,直接检测和 分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法。 基因突变检测法可检测基因犬片段缺失和插入 小片段缺失和插入、点突变(只有一种类型的点突 变,或像N-ras突变那样,突变类型很多但只有 两种占优势,或发生在限制酶识别位点上使酶切位 点消失,或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加、异 常基因重排和异常基因融合等的检测。较大片段用 Southern印迹法或PCR法。单个外显子突变采用双
第一节 基因诊断的策略 一、基因突变的检测 当致病基因已和分子机制均确知时,直接检测和 分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法。 基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入、 小片段缺失和插入、点突变(只有一种类型的点突 变,或像N-ras突变那样,突变类型很多但只有一 两种占优势,或发生在限制酶识别位点上使酶切位 点消失,或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加、异 常基因重排和异常基因融合等的检测。较大片段用 Southern印迹法或PCR法。单个外显子突变采用双
引物PCR法,多个外显子突变采用 multiplexor进 电泳条带分析,单个突变点采用 PCR-SSCP法。 测mRNA用 RT-PCR法。 二、基因连锁分析 由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相 互存在连锁关系,在只知致病基因在染色体上的大 概位置而不知确切位置的情况下,只要鉴定与致病 基因相连锁的有关基因的存在与否,就可以判断受 检者是否带有致病基因。常采用限制性片段长度多 态性(RFLP)遗传标志进行多态性分析
引物PCR法,多个外显子突变采用multiplexPCR进 行电泳条带分析,单个突变点采用PCR-SSCP法。 测mRNA用RT-PCR法。 二、基因连锁分析 由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相 互存在连锁关系,在只知致病基因在染色体上的大 概位置而不知确切位置的情况下,只要鉴定与致病 基因相连锁的有关基因的存在与否,就可以判断受 检者是否带有致病基因。常采用限制性片段长度多 态性(RFLP)遗传标志进行多态性分析
感染性疾病外源基因的检测 这类检测一般根据已知病原生物基因组外源 DNA或RNA顺序,采用PCR或 RT-PCR的方法就 可以进行快速、简便而准确的诊断。因此,这类 疾病的基因诊断应用性极强,在严格掌握质控的 前提下,可在临床广泛运用。 四、基因异常表达的检测 用mRNA作标本,采用RT-PCR法进行半定量和 定量分析判断基因表达异常
三、感染性疾病外源基因的检测 这类检测一般根据已知病原生物基因组外源 DNA或RNA顺序,采用PCR或RT-PCR的方法就 可以进行快速、简便而准确的诊断。因此,这类 疾病的基因诊断应用性极强,在严格掌握质控的 前提下,可在临床广泛运用。 四、基因异常表达的检测 用mRNA作标本,采用RT-PCR法进行半定量和 定量分析判断基因表达异常
第二节基因诊断的常用技术方法 核酸分子杂交技术 ()限制性内切酶酶谱分析法图161) MstⅡ酶切位点( CCTNAGO) 正常基因 0.2kb 突变基因 1.35kb 1一正常人;2一突变携带者;3—患者 图16-1镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
第二节 基因诊断的常用技术方法 一、核酸分子杂交技术 ㈠ 限制性内切酶酶谱分析法(图16-1)
此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针 来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发 生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变, 其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多 少)在电泳迁移率上也会随之改变,借此可作出分 析诊断。 (DNA限制性片段长度多态性 (restriction fragnent| ength polymor- phism,RFLP)分析 在人类基因组中,平均约200对碱基可发生一对 变异(称为中性突变),中性突变导致个体间核苷酸 序列的差异,称为DNA多态性。不少DNA多态性 发生在限制性内切酶识别位点上,酶解该DNA片 段就会产生长度不同的片段,称为限制性片段长 度多态性
此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针 来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发 生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变, 其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多 少)在电泳迁移率上也会随之改变,借此可作出分 析诊断。 ㈡ DNA 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (restriction fragnent length polymor- phism, RFLP)分析 在人类基因组中,平均约200对碱基可发生一对 变异(称为中性突变),中性突变导致个体间核苷酸 序列的差异,称为DNA多态性。不少DNA多态性 发生在限制性内切酶识别位点上,酶解该DNA片 段就会产生长度不同的片段,称为限制性片段长 度多态性
等位基因特异寡核苷酸探针( allele specific oligonucleotide,ASO杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列,人工合 成两种寡核苷酸探针,一种是相应于突变基因碱 基序列的寡核苷酸M,一种是相应于正常基因碱 基序列的寡核苷酸N),用它们分别与受检者DNA 进行分子杂交
㈢ 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO)杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列,人工合 成两种寡核苷酸探针,一种是相应于突变基因碱 基序列的寡核苷酸(M),一种是相应于正常基因碱 基序列的寡核苷酸(N),用它们分别与受检者DNA 进行分子杂交