二、基因工程的基本程序 剪切 载体质粒 选出含有重 引入宿 →组DNA的细 主细胞 胞扩增表达 外源DNA片段外源DNA插入
二、基因工程的基本程序 载体质粒 外源DNA片段 外源DNA插入 剪切 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达 a b b A A b
第五章分子克隆常用的工具酶 第一节限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切制 第二节DNA接酶和DNA分子的 体外连接 第三节其他工具
第五章 分子克隆常用的工具酶 第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶
第一节限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割 限制性核酸内切酶,是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切 割DNA双链结构的核酸内切酶。 寄主控制的限制与修饰作用如图2 限制性核酸内切酶的制备方法 限制性核酸内切酶分类和命名 四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 ●五、影响限制性内切酶活性的因素
第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切 割DNA双链结构的核酸内切酶。 ⚫ 一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2- 2 ⚫ 二、限制性核酸内切酶的制备方法 ⚫ 三、限制性核酸内切酶分类和命名 ⚫ 四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 ⚫ 五、影响限制性内切酶活性的因素
分类:IIⅢ Ⅰ:识别和切割位点不固定,随机性。 Ⅲ:核酸内切酶活性和甲基化活性是 不分开的。 Ⅱ:能在识别位点处切割DNA,切割位 点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性 是分开的。常用
分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ ：识别和切割位点不固定，随机性。 Ⅲ ：核酸内切酶活性和甲基化活性是 不分开的。 Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位 点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性 是分开的。常用
四、工型限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列:1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序 列 回文结构:两个顺序相同的拷贝 在DNA链上呈反向排列 ECoR I 5,-GlAATTC-3 3-CTTAA G-5
四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序 列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝 在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’
●经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型 1.粘性末端 1)3OH单链延伸的粘性末端如:PstI 5 CTGCA↓G-3 5° CTGCAG-3 3-G ACGTC-5 3-G ACGTC-5 (2)5-P单链延伸的粘性末端如: ECOR I 5,-GAATTC-3 -G AATTC-3 3'-CTTAA G-5 32-CTTAA G
⚫经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型 1.粘性末端 (1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst Ⅰ 5’-CTGCA G-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ (2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ 5’-G AATTC-3’ 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’
2平末端如:SmaI 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5 两种特殊的限制酶 1)同尾醢识别位点不同,酶切后产生同样的粘性末段的 两种酶。如: BamH I和Bgll (2)同裂酶识别序列相同,对甲基化切点敏感性不同的两 种酶。如:MboI和Sau3AI共同识别序列GATC,但对 GmeATC切点,前者不能切,后者能切
2.平末端 如:SmaⅠ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ 两种特殊的限制酶 (1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的 两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ (2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两 种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对 GmeATC切点,前者不能切，后者能切
●五、影响限制性内切酶活性的因素 1DNA的纯度 ●2.DNA的甲基化 ●(1)基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 ●(2)研究基因工程DNA的甲基化程度 ●(3)改变限制酶的识别特性 ●3.温度 4分子结构 ●5.限制酶的缓冲液 ●星号活性 ● ECoR I切 GATTO ECOR I*切 pupuATpypy或AATT
⚫ 五、影响限制性内切酶活性的因素 ⚫ 1.DNA的纯度 ⚫ 2. DNA的甲基化 ⚫ （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 ⚫ （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 ⚫ （3）改变限制酶的识别特性 ⚫ 3.温度 ⚫ 4.分子结构 ⚫ 5.限制酶的缓冲液 ⚫ 星号活性 ⚫ EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT
第二节DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 DNA连接酶 DNA连接酶( Ligase)是一种能 够催化在双股DNA链的3-OH和5-P 之间形成磷酸二酯键的酶,可连接互 补粘性末端或平端以及缺口修复,不 能连接单链DNA或裂口 温度 二、DNA分子的体外连接
第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 ⚫ 一、DNA连接酶 DNA连接酶（Ligase）是一种能 够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P 之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互 补粘性末端或平端以及缺口修复，不 能连接单链DNA或裂口. 温度 ⚫ 二、DNA分子的体外连接
二、DNA分子的体外连接 ●1.粘性末端DNA片段的连接和单切点 磷酸化 2.平末端DNA片段的连接 (1)TDNA连接酶法 ●(2)同聚物加尾法 (3)用化学合成的衔接物连接DNA分
二、DNA分子的体外连接 ⚫ 1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的 磷酸化 ⚫ 2．平末端DNA片段的连接 ⚫ （1）T4DNA连接酶法 ⚫ （2）同聚物加尾法 ⚫ （3）用化学合成的衔接物连接DNA分子