第七章核酸分子杂交 核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸 单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异 质双链的过程,即来源不同的两条单链核酸分子通过 碱基互补可形成异源双螺旋,称为核酸分子杂交 (hybridization)o 具有灵敏度高、特异性强等优点 主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测
第七章 核酸分子杂交 核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸 单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异 质双链的过程, 即来源不同的两条单链核酸分子通过 碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交 (hybridization)。具有灵敏度高、特异性强等优点， 主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测
第一节核酸分子杂交的基本原理 第二节核酸探针 第三节核酸分子杂交技术
•第一节 核酸分子杂交的基本原理 •第二节 核酸探针 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节核酸分子杂交的基本原理 DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的DNA或RNA的片段作为探针,包括 特异的DNA序列,或转录的RNA序列或cDNA序列, 或人王合成的寡核苷酸片段 根据支持物的不同,分为固相杂交和液相杂交。 固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。 膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后,在体外 与探针杂交,细胞原位杂交是在细胞内进行的交
第一节 核酸分子杂交的基本原理 DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间， 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的DNA或RNA的片段作为探针，包括 特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列， 或人工合成的寡核苷酸片段。 根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。 固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。 膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外 与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交
杂交的稳定性(表7 Tm是核酸双链解链成单链过程中,其克原子消光 系数e(P)值的增加达到最高值一半时的温度。不同 杂交双链其Tm值不同,影响因素有: (1)杂交链GC含量愈高的杂交双链其Tm值愈高。 (2)杂交链愈长其Tm值愈高。 (3)杂交双链的碱基错配程度。 (4)溶液的离子强度越大,Tm值愈高。 变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成,可降低 Tm值,常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用50%的 甲酰胺大约可使杂交双链的Tm值降低30℃
一、杂交的稳定性（表7-1） Tm是核酸双链解链成单链过程中，其克原子消光 系数 (P)值的增加达到最高值一半时的温度。不同 杂交双链其Tm值不同，影响因素有： (1) 杂交链GC含量愈高的杂交双链其Tm值愈高。 (2) 杂交链愈长其Tm值愈高。 (3) 杂交双链的碱基错配程度。 (4) 溶液的离子强度越大，Tm值愈高。 变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成，可降低 Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用50%的 甲酰胺大约可使杂交双链的Tm值降低30℃
表71常数A、B、C值 双链种类 常数 DNA/DNA RNA/DNA RNA/RNA 81.5 78 ABc 0.4l1 0.80 0.70 0.35
杂交动力学 杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局 部双链,如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新 解离,继续碰撞,一且找到正确的互补区,两侧的序 列迅速配对形成完整的双链分子,后一步反应是一个 自发过程。 影响因素主要有 (1)探针浓度、长度和复杂性 探针浓度越高,复性速度越快。 探针越长,扩散速度越慢,复杂性越高,配对难度越 大
二、杂交动力学 杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局 部双链，如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新 解离，继续碰撞，一旦找到正确的互补区，两侧的序 列迅速配对形成完整的双链分子，后一步反应是一个 自发过程。 影响因素主要有： (1) 探针浓度、长度和复杂性 探针浓度越高，复性速度越快。 探针越长，扩散速度越慢，复杂性越高，配对难度越 大
(2)离子强度 高离子强度溶液中,其正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷,消除其间的静电斥力,有利于杂交分 子的形成。 (3)温度 通常杂交温度在低于Tm20-25℃温度下进行。不 含变性剂甲酰胺时,大多数杂交反应在68℃进行。当 含50%甲酰胺时,在42℃进行。 寡核苷酸探针“般在低于T值5℃-10℃下进行 4)杂交促进剂 用硫酸葡聚糖,其微粒的表面可以吸附DNA探针 分子,使接触面积增大,有利于杂交反应
(2) 离子强度 高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分 子的形成。 (3) 温度 通常杂交温度在低于Tm 20~25℃温度下进行。不 含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行。当 含50%甲酰胺时，在42℃进行。 寡核苷酸探针一般在低于Tm值5℃~10℃下进行。 (4) 杂交促进剂 用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA探针 分子，使接触面积增大，有利于杂交反应
(5)杂交条件的严谨性 所谓严谨性 ( stringency,是指杂交反应体系, 避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复 合物的严格程度。反应温度升高,离子强度降低, 会增加反应的严谨性,适用于匹配好的或序列完全 同源的核酸的杂交反应,或用于检测点突变;反之, 则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应
(5) 杂交条件的严谨性 所谓严谨性(stringency)，是指杂交反应体系， 避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复 合物的严格程度。反应温度升高，离子强度降低， 会增加反应的严谨性，适用于匹配好的或序列完全 同源的核酸的杂交反应，或用于检测点突变；反之， 则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应
第二节核酸探针 核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他 活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 核酸探针的类型 ()基因组DNA探针 用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编 码序列(外显子) cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA,特异性高,是 种较理想的核酸探针
第二节 核酸探针 核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他 活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 一、核酸探针的类型 ㈠ 基因组DNA探针 用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编 码序列(外显子)。 ㈡ cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，特异性高，是 一种较理想的核酸探针
RNA探针 RNA探针有下述优点: ①杂交体的稳定性高,杂交反应条件严格,特异性更 高 ②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性 杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列,非特异杂交少。 ④杂交后用RNa消化未杂交的RNA探针,可降低杂 交本底
㈢ RNA探针 RNA探针有下述优点： ①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更 高。 ②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性， 杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。 ④杂交后用RNase消化未杂交的RNA探针，可降低杂 交本底