第八章聚合酶链反应 1985年PE-ctu公司的人类遗传研究室Muli等人发 明了具有划时代意义的聚合酶链式反应( polymerase chain reaction,PCR)。此技术能够特异地扩增任何所希望的目 的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等 方面有重要的应用价值,并对分子生物学技术的发展给予 巨大的推动
第八章 聚合酶链反应 1985年PE-cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发 明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。此技术能够特异地扩增任何所希望的目 的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等 方面有重要的应用价值，并对分子生物学技术的发展给予 巨大的推动
第一节PCR原理与特点 第二节PCR类型 第三节PCR技术在医学上的应用
•第一节 PCR原理与特点 •第二节 PCR类型 •第三节 PCR技术在医学上的应用
PCR的基本原理 在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件—模板DNA 寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲液系统和DNA变性、复 性及延伸的温度与时间等,使目的DNA得以迅速扩增(图8-1)。 基因组DNA 94℃,300s 引物 Taq dna聚合酶72℃,60s 94℃,60 55℃,60s 72℃,60s 72℃,60s 30次循环 图81PCR技术原理示意
一、PCR的基本原理 在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA， 寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复 性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增(图8-1)
()DNA模板变性 双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性,形成 单链DNA。 模板与引物退火 将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的 序列互补。通过控制退火条件,引物就能准确地与扩增区 域的两端配对。 白引物延伸 在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下,DNA聚合酶在最 适作用温度可将单核苷酸从引物3‘端掺入,沿模板延伸合 成新股DNA,每一循环的产物可作为下一循环的模板
㈠ DNA模板变性 双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性，形成 单链DNA。 ㈡ 模板与引物退火 将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的 序列互补。通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区 域的两端配对。 ㈢ 引物延伸 在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下，DNA聚合酶在最 适作用温度可将单核苷酸从引物3′端掺入，沿模板延伸合 成新股DNA，每一循环的产物可作为下一循环的模板
以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为 PCR的一轮循环,整个PCR过程一般需进行三十轮的循 环 按2η的指数方式递增,PCR扩增量应达到230个拷贝 平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数 所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素
以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为 PCR的一轮循环，整个PCR过程一般需进行三十轮的循 环。 按2 n的指数方式递增， PCR扩增量应达到2 30个拷贝， “平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、 所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素
二、PCR技术的特点 ()高度的敏感性 PCR产物的生成是以指数方式增加的,即使按75%的 扩增效率计算,单拷贝基因经25次循环后,其基因拷贝数 也在100万以上,即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光 下可见的水平(μg级)。 高度的特异性 PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的 互补程度,即引物与模板结合的正确性。 白操作简便、快速 四适用样品广泛 含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可用作反应 的起始材料
二、PCR技术的特点 ㈠ 高度的敏感性 PCR产物的生成是以指数方式增加的，即使按75%的 扩增效率计算，单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数 也在100万以上，即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光 下可见的水平(g级)。 ㈡ 高度的特异性 PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的 互补程度，即引物与模板结合的正确性。 ㈢ 操作简便、快速 ㈣ 适用样品广泛 含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可用作反应 的起始材料
常规的PCR操作 ()反应体系 标准PCR反应体积为50-100ul,其中含有:1XPCR 反应缓冲液、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP dTTP)、二种上、下游引物、DNA模板、 Taq dna聚合 酶 (=反应步骤 四、PCR反应条件的优化 ()模板核酸 PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的 扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环
三、常规的PCR操作 ㈠ 反应体系 标准PCR反应体积为50~100l，其中含有：1PCR 反应缓冲液、四种 dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP 、 dTTP)、二种上、下游引物、DNA模板、Taq DNA聚合 酶。 ㈡ 反应步骤 四、PCR反应条件的优化 ㈠ 模板核酸 PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的 扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环
(引物 引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸, 两段引物分别与相应的一条DNA链3端及5端互补。 引物设计一般遵循下列原则: (1)引物的序列应选定基因组DNA的高度保守区,以减少 引物与基因组的非特异结合,提高反应的特异性 (2)引物的长度以1540bp为宜 (3)引物的碱基尽可能随机分布,避免出现数个嘌呤或嘧 啶的连续排列,G+C碱基的含量在40%75%之间。 (4)引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的未端应 无回文结构
㈡ 引物 引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸， 两段引物分别与相应的一条DNA链3’端及5’端互补。 引物设计一般遵循下列原则： (1) 引物的序列应选定基因组DNA的高度保守区，以减少 引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。 (2) 引物的长度以15~40bp为宜。 (3) 引物的碱基尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧 啶的连续排列，G+C碱基的含量在40%~75%之间。 (4) 引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应 无回文结构
5)二个引物之间不应有互补序列,以免形成“引物二聚 体”,浪费引物。 (6)引物5‘末端碱基无严格限制,在与模板结合的引物长 度足够的条件下,其5端碱基互补程度无严格限制。 (7)引物3端的头1~2个碱基会影响 Taq dna聚合酶的延 伸效率,从而影响PCR反应的扩增效率及特异性,因此选 择合适的3端碱基很重要。最好选T、C、G,不选A (8)引物的3端应为保守氨基酸序列,即采用简并密码少 的氨基酸如Met、Trp,且要避免三联体密码第3个碱基的 摆动位置位于引物的3'末端
(5) 二个引物之间不应有互补序列，以免形成“引物二聚 体” ，浪费引物。 (6) 引物5′末端碱基无严格限制，在与模板结合的引物长 度足够的条件下，其5′端碱基互补程度无严格限制。 (7) 引物3′端的头1~2个碱基会影响Taq DNA聚合酶的延 伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性，因此选 择合适的3′端碱基很重要。最好选T、C、G，不选A (8) 引物的3′端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少 的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第3个碱基的 摆动位置位于引物的3′末端
白耐热DNA聚合酶 Taq dna酶有良好的热稳定性, Taq dna聚合酶在 70~75℃时具有最高的生物学活性。 四脱氧核苷三磷酸 脱氧核苷三磷酸(dNTP)是dATP、dCTP、dGTP和 dTTP的总称,是靶DNA序列扩增的原料。dNTP浓度取 决于扩增片段的长度、MgCl2浓度、引物浓度等反应条件 (缓冲液 目前最为常用的缓冲液体系为10-50mmo/ L Tris-HCI (pH83~8.8,20℃)。 Gy Mg2+ .Mg2浓度过低会使W海活性丧失、PCR产量下降 2+浓度过高则影响PCR反应的特异性
㈢ 耐热DNA聚合酶 Taq DNA酶有良好的热稳定性，Taq DNA聚合酶在 70~75℃时具有最高的生物学活性。 ㈣ 脱氧核苷三磷酸 脱 氧 核 苷 三 磷酸 (dNTP)是 dATP 、dCTP 、dGTP 和 dTTP的总称，是靶DNA序列扩增的原料。dNTP浓度取 决于扩增片段的长度、MgCl2浓度、引物浓度等反应条件。 ㈤ 缓冲液 目前最为常用的缓冲液体系为10~50mmol/L Tris-HCl (pH 8.3~8.8,20℃)。 ㈥ Mg2+ Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+浓度过高则影响PCR反应的特异性