第二章生产菌种的来源 微生物产生是各种活性物的源泉,资 源丰富。 医药50%的化合物与天然产物有关 微生物菌种资源开发和利用的前景十 分广阔
第二章 生产菌种的来源 微生物产生是各种活性物的源泉，资 源丰富。 医药50％的化合物与天然产物有关。 微生物菌种资源开发和利用的前景十 分广阔
2.1产生新菌种获得 新的微生物菌种需要从自然生 态环境中混杂的微生物群中挑选出 来,因此必须要有快速而准确的新 种分离和筛选方法
2.1 产生新菌种获得 新的微生物菌种需要从自然生 态环境中混杂的微生物群中挑选出 来，因此必须要有快速而准确的新 种分离和筛选方法
调查研究并充分查阅资料 设计试验方案 确定采样的生态环境 确定特定的增殖条件 橙道培养 确定定性或半定量的快速检测方法 种分离 典型的微生物新种分离筛选过程 原种斜面 确定发酵的基本条件 初筛(快速检测或一菌株1摇瓶培养测定) 复筛(一菌株3^5摇瓶) ↓结合初步的工艺条件 再复筛 较优菌株斜面(3ˆ5菌株 分离微生物新种的具体过程大体 生产性能试验 可分为采样、增殖、纯化和性能 性能鉴定 毒性试验 测定 菌种鉴定 菌种保藏及作为进一步育种的岀发菌株
典型的微生物新种分离筛选过程 分离微生物新种的具体过程大体 可分为采样、增殖、纯化和性能 测定
2.1.1微生物采样 采样原则: 材料来源越广泛,越有可能获得 新的菌种。 可寻找已适应各种环境压力的微 生物类群
2.1.1 微生物采样 采样原则： 材料来源越广泛，越有可能获得 新的菌种。 可寻找已适应各种环境压力的微 生物类群
2.1.2材料的预处理 为了提高分离效率,需用不同 的方法处理材料 处理方法:物理方法(加热); 化学方法(pH);诱饵法
2.1.2 材料的预处理 为了提高分离效率，需用不同 的方法处理材料。 处理方法：物理方法（加热）； 化学方法（pH）；诱饵法
2.1.3菌株的分离 2.1.3.1施加选择性压力分离法: 分离的效率处决于培养基养分,pH,加于选择性 抑制剂 常用几丁质培养基分离土壤和水中的放线菌 大多数放线菌培养基pH在67~7.5,嗜酸菌pH在 4.5~5.0。 在分离放线菌和细菌时,可加抗真菌抗生素;分离 真菌时,加抗细菌抗生素
2.1.3 菌株的分离 2.1.3 .1 施加选择性压力分离法： 分离的效率处决于培养基养分， pH，加于选择性 抑制剂。 常用几丁质培养基分离土壤和水中的放线菌。 大多数放线菌培养基pH在6.7~7.5，嗜酸菌pH在 4.5~5.0。 在分离放线菌和细菌时，可加抗真菌抗生素；分离 真菌时，加抗细菌抗生素
培养方法可采用分批式富集培养(摇瓶培养) 和恒化富集培养(连续培养) 分批式富集培养分批式富集培养是将富集培养 物转接到新的同一种培养基中,重新建立选择性 压力,如此重复转种几次后,再取此富集培养物 接种到固体培养基上,以获得单菌落。 恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度 来控制不同菌株的比生长速率
培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养） 和恒化富集培养（连续培养）。 分批式富集培养分批式富集培养是将富集培养 物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性 压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物 接种到固体培养基上，以获得单菌落。 恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度， 来控制不同菌株的比生长速率
2.1.3.2随机分离筛选法 些微生物的产物对生产菌的筛选没有直接的选 择性作用,常用随机分离法进行分离 (1)抗生素生产菌的分离 将摇瓶培养的过滤液或细胞提取液、混合提取液: 用联合试验菌筛选:如黄色霉素抗生素就是用 枯草杄菌和绿色产色链霉菌或巴式梭状芽孢杄菌筛 选出的。 利用与抗生素作用机制相关的酶筛选:如棒 酸
2.1.3.2 随机分离筛选法 一些微生物的产物对生产菌的筛选没有直接的选 择性作用，常用随机分离法进行分离 (1) 抗生素生产菌的分离 将摇瓶培养的过滤液或细胞提取液、混合提取液： 用联合试验菌筛选：如黄色霉素抗生素就是用 枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴式梭状芽孢杆菌筛 选出的。 利用与抗生素作用机制相关的酶筛选：如棒 酸
(2)药理活性化合物的分离-体外筛选 筛选能抑制生物代谢途径中一关键性酶(靶 酶或靶标酶)的活性 抗高血压:用血管紧张素转移酶 ATP Glutamine AMP+PPi Glutamate Aspartate Asparagine Protein Asparagine synthetase 2-hydroxy-1, 4-cineol methylin 图1.天冬酰胺合成酶催化反应及其除草剂 Cinmethylin的作用机理
(2) 药理活性化合物的分离-体外筛选 筛选能抑制生物代谢途径中一关键性酶（靶 酶或靶标酶）的活性。 抗高血压：用血管紧张素转移酶 Aspartate Asparagine synthetase ATP Glutamine AMP+PPi Glutamate Asparagine Protein 2-hydroxy-1,4-cineole Cinmethylin 图 1. 天冬酰胺合成酶催化反应及其除草剂Cinmethylin的作用机理
(3)抗肿瘤药物生产菌的分离 利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物--具有灵敏度高 简便快速的特点。 生化诱导法筛选:采用测定溶原性噬菌体阻遏物支配下的启 动子控制的转录和表达的酶活性的方法,即将大肠杆菌的acZ基 因连接在噬菌体的P启动子下,当DNA损伤时,诱发阻遏蛋白Cl 分解,P启动子启动acZ基因转录,测定表达的半乳糖苷酶活性, 来检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在。 SOS生色检测法:利用DNA损伤时,可活化yecA蛋白,进而 分解噬菌体的阻遏蛋白,再引起sifA(slA)基因启动子启动acZ基 因的表达,从而达到检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的目的。 利用DNA修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选:在生物体 中都存在两个以上的DNA修复基因,如果有一个DNA修复基因 损伤或变异,通常任能存活,但对能引起DNA损伤的化合物十分 敏感,易生产死亡。如使用大肠杆菌或枯草芽孢杄菌的重组缺失 DNA修复基因突变株和亲本株作为测试菌来筛选抗肿瘤药物
(3) 抗肿瘤药物生产菌的分离 利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物---具有灵敏度高、 简便快速的特点。 生化诱导法筛选：采用测定溶原性噬菌体阻遏物支配下的启 动子控制的转录和表达的酶活性的方法，即将大肠杆菌的 lacZ基 因连接在噬菌体的Pl启动子下，当DNA损伤时，诱发阻遏蛋白 Cl 分解， Pl启动子启动lacZ基因转录，测定表达的半乳糖苷酶活性， 来检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在。 SOS生色检测法：利用DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而 分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA(sulA)基因启动子启动lacZ基 因的表达,从而达到检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的目的。 利用DNA修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选：在生物体 中都存在两个以上的DNA修复基因，如果有一个DNA修复基因 损伤或变异，通常任能存活，但对能引起DNA损伤的化合物十分 敏感，易生产死亡。如使用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的重组缺失 DNA修复基因突变株和亲本株作为测试菌来筛选抗肿瘤药物