基因工程常用技术 包括①凝胶电泳②细菌的转化和转染③核酸 分子杂交④定点突变⑤PCR⑥RFLP⑦RAPD ⑧DNA序列分析⑨目的基因的分离和转基因 植物、转基因动物等技术。 凝胶电泳:分辨DNA范围使用浓度 琼脂糖凝胶几百-2万bp0.320% 聚丙烯酰胺凝胶6-1000bp 3-20 方法:样品制备→凝胶制备→电泳→染色一 观察。应用于分析;纯化
基因工程常用技术 • 包括①凝胶电泳②细菌的转化和转染③核酸 分子杂交④定点突变⑤PCR⑥RFLP⑦RAPD ⑧DNA序列分析⑨目的基因的分离和转基因 植物、转基因动物等技术。 ▪ 凝胶电泳： 分辨DNA范围 使用浓度 琼脂糖凝胶 几百-2万bp 0.3-2.0% 聚丙烯酰胺凝胶 6-1000bp 3-20% ➢方法：样品制备→凝胶制备→电泳→染色→ 观察。应用于分析；纯化
细菌的转化和转染 ■转化:指受体细胞从周围介质总共吸收外来 DNA片段,使其基因型和表型发生相应变化 ■转染:转化的特殊形式,是用离体状态的噬菌 体、病毒核酸感染细胞,以改变受体遗传组成 ◆关键:①受体细胞是否处于感受态。诱导方法 为:快速生长的细菌+0℃、CaCl2低渗溶液→ 细胞肿胀呈球状(感受态)+DNA→吸附 +42℃短暂处理+MgCl2→吸收②为防止限制, 提高转化效率,可选用无限制作用的突变体
细菌的转化和转染 ▪ 转化：指受体细胞从周围介质总共吸收外来 DNA片段，使其基因型和表型发生相应变化 ▪ 转染：转化的特殊形式，是用离体状态的噬菌 体、病毒核酸感染细胞，以改变受体遗传组成 ❖关键：①受体细胞是否处于感受态。诱导方法 为：快速生长的细菌+0℃、CaCl2低渗溶液→ 细胞肿胀呈球状（感受态）+DNA→吸附 +42℃短暂处理+MgCl2→吸收②为防止限制， 提高转化效率，可选用无限制作用的突变体
定点突变的诱发 ■这项技术是加拿大的 M Smith70年代创造,获 1993年诺贝尔化学奖。 ■也称位点专一诱变。是一种反向遗传学方法。 即将克隆基因在体外按预先的设计利用核酸 酶、诱变剂等来诱发位点特异性突变,或将 预先确定的碱基改变引入人工合成的寡核苷 酸再组入基因中,然后将已知缺失、插入 碱基替换、移码等不同类型的突变基因导入 受体细胞,再进行选择、分析突变表型。 这里仅介绍寡核苷酸定点突变
定点突变的诱发 ▪ 这项技术是加拿大的M.Smith70年代创造，获 1993年诺贝尔化学奖。 ▪ 也称位点专一诱变。是一种反向遗传学方法。 即将克隆基因在体外按预先的设计利用核酸 酶、诱变剂等来诱发位点特异性突变，或将 预先确定的碱基改变引入人工合成的寡核苷 酸再组入基因中，然后将已知缺失、插入、 碱基替换、移码等不同类型的突变基因导入 受体细胞，再进行选择、分析突变表型。 ➢这里仅介绍寡核苷酸定点突变
寡核苷酸定点突变(图) 原理及步骤 单链重組子DNA 有错配碱基的寡聚核苷酸 ))变越固 岽交還火 DNA聚合, dTPs DNA连接 转化或转柒大肠杆菌 野生型50% 突变型50%
寡核苷酸定点突变（图） • 原理及步骤
核酸分子杂交 1968年由 Boy britten等人发明 原理:DNA或RNA(带互补的特定核苷酸序 列)→混合(退火)→同源区段形成双链结 构→杂种核酸分子(来源不同) 类型: Southern杂交; Northern杂交;原位杂 交( bolting Southern杂交:将电泳凝胶中的DNA片段转 移并结合在适当的滤膜上,然后通过同DNA 或RNA探针杂交检测同源片段的方法。见图
核酸分子杂交 • 1968年由Boy Britten等人发明 • 原理：DNA或RNA（带互补的特定核苷酸序 列）→混合（退火）→同源区段形成双链结 构→杂种核酸分子（来源不同） • 类型：Southern杂交；Northern杂交；原位杂 交（boltting） • Southern杂交：将电泳凝胶中的DNA片段转 移并结合在适当的滤膜上，然后通过同DNA 或RNA探针杂交检测同源片段的方法。见图
Southern杂交图 图 Southern转移和分子杂交的过程 重物 DNA 平板 (EB柒色) 一滤纸 NC滤膜 碱变性 转移 凝胶 (ga1) 滤纸缓冲液支持物 放射自显影 涉脱 链DNA 显影胶片 NC滤膜和探针 NC滤膜
Southern杂交图 图.Southern转移和分子杂交的过程
Northern杂交 又称RNA印迹技术,是将RNA分子从电泳凝 胶转移到NC滤膜上进行杂交的一项技术 由 J.C. Alwinex等在1979年建立 它与 Southern杂交十分相似,不同之处只是 从凝胶中转移到滤膜的是RNA而不是DNA 类似的转移蛋白质的方法叫 Western杂交 应用 northern杂交技术可以了解特定基因的 表达情况
Northern杂交 • 又称RNA印迹技术，是将RNA分子从电泳凝 胶转移到NC滤膜上进行杂交的一项技术。 • 由J.C.Alwinex等在1979年建立 • 它与Southern杂交十分相似，不同之处只是 从凝胶中转移到滤膜的是RNA而不是DNA • 类似的转移蛋白质的方法叫Western杂交 • 应用Northern杂交技术可以了解特定基因的 表达情况
原位杂交 是在 Southern杂交技术的基础上发展起来的 菌落(或噬菌斑)杂交,其方法是将培养皿中的菌 落印迹到NC滤膜上,溶菌,使变性的DNA与滤膜 牢固结合。然后按照 Southern杂交的方法进行分子 杂交和显影。常用于目的克隆(菌落)的筛选。 (见下图) ·细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品,步骤 包括组织固定、脱水、石蜡包埋和切片。转移至滤 膜并在原位进行杂交,放射性同位素标记的DNA或 RNA探针与待测DNA的互补配部位,可通过放射性 自显影显示出来
原位杂交 • 是在Southern杂交技术的基础上发展起来的 • 菌落（或噬菌斑）杂交，其方法是将培养皿中的菌 落印迹到NC滤膜上，溶菌，使变性的DNA与滤膜 牢固结合。然后按照Southern杂交的方法进行分子 杂交和显影。常用于目的克隆（菌落）的筛选。 （见下图） • 细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品，步骤 包括组织固定、脱水、石蜡包埋和切片。转移至滤 膜并在原位进行杂交，放射性同位素标记的DNA或 RNA探针与待测DNA的互补配部位，可通过放射性 自显影显示出来
琼脂平板 ⅣC滤膜在琼脂平板 上印迹,取出滤膜 ￠∵ 保留母極 ⅣC滤膜 位置标记 繡3 处理裂解细胞 洗,烘烤固定 与NC滤膜结合的DNA 阳性菌落 与母板对比 选取阳性菌落 探针 保温,漂洗 与探针杂交的克隆 自显影胶片 放射自显影 菌落原位杂交技术原理
PCR技术 PCR: polymerase chain reaction的缩写 叫做聚合酶链式反应技术 ·1985年,美国 Kerry mullis发明 荣获1993年诺贝尔化学奖 原理:引物延伸反应产生的子链DNA经热变 性为单链后,有可作为模板,在引物和DNA 聚合酶的作用下指导新的子链的合成。 需要:引物(一对);酶(如 agINA聚合 酶);dNTP;缓冲液;水(超纯水)
PCR技术 • PCR：polymerase chain reaction的缩写 • 叫做聚合酶链式反应技术 • 1985年，美国Kerry Mullis发明 • 荣获1993年诺贝尔化学奖 • 原理：引物延伸反应产生的子链DNA经热变 性为单链后，有可作为模板，在引物和DNA 聚合酶的作用下指导新的子链的合成。 • 需要：引物（一对）；酶（如TagDNA聚合 酶）；dNTP ；缓冲液；水（超纯水）