实验 14 植物组织中淀粉含量的测定 Ⅰ 蒽酮硫酸法 一、原理 淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用 下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测 定。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物材料。 （二）试剂 • 浓硫酸（比重 1.84 ）。 • 9.2mol/L HClO 4 。 • 蒽酮试剂，同实验 24 。 （三）仪器设备 电子天平，容量瓶： 100 mL 4 个、 50 mL 2 个，漏斗，小试管若干支，电炉，刻度吸管 0.5mL 1 支、 2.0 mL 3 支、 5 mL 4 支，分光光度计，记号笔。 三、实验步骤 1. 标准曲线制作 同实验 24 恩酮法。 2. 样品提取 称取 50 ～ 100 mg 粉碎过 100 目筛的烘干样品，置于 15 mL 刻度试管中，加 入 6 ～ 7 mL 80 ％乙醇，在 80 ℃水浴中提取 30 min ，取出离心（ 3000 rpm ） 5 min ， 收集上清液。重复提取两次（各 10 min ）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于 85 ℃ 恒温水浴，使乙醇蒸发至 2 ～ 3 mL ，转移至 50 mL 容量瓶，以蒸馏水定容，供可溶性糖的 测定。 向沉淀中加蒸馏水 3 mL ，搅拌均匀，放入沸水浴中糊化 15 min 。冷却后，加入 2 mL 冷的 9.2 mol/L 高氯酸，不时搅拌，提取 15 min 后加蒸馏水至 10 mL ，混匀，离心 10 min ， 上清液倾入 50 mL 容量瓶。再向沉淀中加入 2 mL 4.6 mol/L 高氯酸，搅拌提取 15 min 后 加水至 10 mL ，混匀后离心 10 min ，收集上清于容量瓶。然后用水洗沉淀 1 ～ 2 次，离 心，合并离心液于 50 mL 容量瓶用蒸馏水定容供测淀粉用。 3. 测定 取待测样品提取液 1.0 mL 于试管中，再加蒽酮试剂 5 mL ，快速摇匀，然后在沸水 浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，从标准曲线查出糖 含量（ μg ）。 四、结果计算 式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， μg 。 V T ——样品提取液总体积 , mL 。 V 1 ——显色时取样品液量， mL 。 W ——样品重， g 。 0.9 ——由葡萄糖换算为淀粉的系数。 Ⅱ 碘 - 淀粉比色法 一、原理
实验 14 植物组织中淀粉含量的测定 Ⅰ 蒽酮硫酸法 一、原理 淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用 下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测 定。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物材料。 （二）试剂 • 浓硫酸（比重 1.84 ）。 • 9.2mol/L HClO 4 。 • 蒽酮试剂，同实验 24 。 （三）仪器设备 电子天平，容量瓶： 100 mL 4 个、 50 mL 2 个，漏斗，小试管若干支，电炉，刻度吸管 0.5mL 1 支、 2.0 mL 3 支、 5 mL 4 支，分光光度计，记号笔。 三、实验步骤 1. 标准曲线制作 同实验 24 恩酮法。 2. 样品提取 称取 50 ～ 100 mg 粉碎过 100 目筛的烘干样品，置于 15 mL 刻度试管中，加 入 6 ～ 7 mL 80 ％乙醇，在 80 ℃水浴中提取 30 min ，取出离心（ 3000 rpm ） 5 min ， 收集上清液。重复提取两次（各 10 min ）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于 85 ℃ 恒温水浴，使乙醇蒸发至 2 ～ 3 mL ，转移至 50 mL 容量瓶，以蒸馏水定容，供可溶性糖的 测定。 向沉淀中加蒸馏水 3 mL ，搅拌均匀，放入沸水浴中糊化 15 min 。冷却后，加入 2 mL 冷的 9.2 mol/L 高氯酸，不时搅拌，提取 15 min 后加蒸馏水至 10 mL ，混匀，离心 10 min ， 上清液倾入 50 mL 容量瓶。再向沉淀中加入 2 mL 4.6 mol/L 高氯酸，搅拌提取 15 min 后 加水至 10 mL ，混匀后离心 10 min ，收集上清于容量瓶。然后用水洗沉淀 1 ～ 2 次，离 心，合并离心液于 50 mL 容量瓶用蒸馏水定容供测淀粉用。 3. 测定 取待测样品提取液 1.0 mL 于试管中，再加蒽酮试剂 5 mL ，快速摇匀，然后在沸水 浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，从标准曲线查出糖 含量（ μg ）。 四、结果计算 式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， μg 。 V T ——样品提取液总体积 , mL 。 V 1 ——显色时取样品液量， mL 。 W ——样品重， g 。 0.9 ——由葡萄糖换算为淀粉的系数。 Ⅱ 碘 - 淀粉比色法 一、原理
对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘–淀粉比色法。淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶 液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘–淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱 液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物材料。 （二）试剂 1 ． 80 ％硝酸钙溶液。 2 ． 0.5 ％碘液：称 5.00 g 结晶碘和 10.00 g 碘化钾，放入研钵混合干研，然后加 10 mL 蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入 1000 mL 容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶。 3 ． 5 ％含碘硝酸钙溶液：取 10 mL 80 ％的硝酸钙溶液，加入 160 mL 水再加入 3 mL 0.5 ％ 的碘液混匀，现用现配。 4 ．标准淀粉溶液：称取纯淀粉 50 mg 于研钵中，加 3 mL 80 ％硝酸钙溶液，研细并转移到 100 mL 的三角瓶中，用 15 mL 80 ％的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。将三 角瓶置于沸水浴中煮沸 5 min ，冷却后全部转入 50 mL 容量瓶中并定容。此液为 1 mg/mL 的 淀粉标准液。 5 ． 0.1 mol/L NaOH 。 6 ． 0.1 mol/L HCl 。 （三）仪器设备 分析天平，研钵，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，电炉，离心机，离心管，试剂瓶。 三、实验步骤 1 ．称取 1 ～ 3 g 叶片，剪碎放入研钵，加 5 mL 80 ％的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入 100 mL 的三角瓶中，用 10 mL 80 ％的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中，瓶口盖上小漏 斗，在沸水浴上煮沸 3 ～ 5 min （叶片含淀粉少的 3 min ，含淀粉多的 5 min ），使样品 中淀粉转变为胶体溶液。 2 ．给三角瓶中加 20 mL 蒸馏水，混合液转入离心管中离心（ 2000 ～ 3000 rpm ） 2 ～ 3 min ，将离心后的淀粉胶体浑浊液移入 100 mL 容量瓶（淀粉含量少时，可移入 50 mL 容量 瓶），三角瓶及离心沉淀物用 5 ～ 10 mL 热蒸馏水冲洗并同样离心，离心液并入容量瓶中（共 洗 2 ～ 3 次）定容，即为淀粉提取液。 3 ．取 5 ～ 10 mL 淀粉待测液，加入到盛有 2 mL 0.5 ％碘液的离心管中，混匀静置 15 min 后离心（ 3000 rpm ） 5 min ，弃上清液。沉淀用 5 ％的含碘硝酸钙溶液冲洗两次，向冲洗 后的沉淀中加入 10 mL 0.1 mol/L 的 NaOH 混匀，将离心管浸入沸水内 5 min ，使沉淀溶解。 将溶液转入 50 mL 容量瓶中，加入 0.3 mL 0.5 ％碘液，用 30 mL 左右的水冲洗并入容量瓶， 加入 2 mL 1mol/L 的盐酸，用水定容并显色，在 590 nm 波长处测定光密度。 4 ．绘制标准曲线 取标准淀粉溶液（ 1 mg/mL ） 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mL 于 6 个离心管中，用 80 ％硝酸钙溶液将各管的体积补足至 5 mL ，再向各管加入 2 mL 0.5 ％碘液，混匀静置 15 min 后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在 590 nm 波 长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mg ，然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。 四、结果计算 式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， mg 。 V T ——样品提取液总体积 , mL 。 V 1 ——显色时取样品液量， mL
对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘–淀粉比色法。淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶 液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘–淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱 液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物材料。 （二）试剂 1 ． 80 ％硝酸钙溶液。 2 ． 0.5 ％碘液：称 5.00 g 结晶碘和 10.00 g 碘化钾，放入研钵混合干研，然后加 10 mL 蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入 1000 mL 容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶。 3 ． 5 ％含碘硝酸钙溶液：取 10 mL 80 ％的硝酸钙溶液，加入 160 mL 水再加入 3 mL 0.5 ％ 的碘液混匀，现用现配。 4 ．标准淀粉溶液：称取纯淀粉 50 mg 于研钵中，加 3 mL 80 ％硝酸钙溶液，研细并转移到 100 mL 的三角瓶中，用 15 mL 80 ％的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。将三 角瓶置于沸水浴中煮沸 5 min ，冷却后全部转入 50 mL 容量瓶中并定容。此液为 1 mg/mL 的 淀粉标准液。 5 ． 0.1 mol/L NaOH 。 6 ． 0.1 mol/L HCl 。 （三）仪器设备 分析天平，研钵，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，电炉，离心机，离心管，试剂瓶。 三、实验步骤 1 ．称取 1 ～ 3 g 叶片，剪碎放入研钵，加 5 mL 80 ％的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入 100 mL 的三角瓶中，用 10 mL 80 ％的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中，瓶口盖上小漏 斗，在沸水浴上煮沸 3 ～ 5 min （叶片含淀粉少的 3 min ，含淀粉多的 5 min ），使样品 中淀粉转变为胶体溶液。 2 ．给三角瓶中加 20 mL 蒸馏水，混合液转入离心管中离心（ 2000 ～ 3000 rpm ） 2 ～ 3 min ，将离心后的淀粉胶体浑浊液移入 100 mL 容量瓶（淀粉含量少时，可移入 50 mL 容量 瓶），三角瓶及离心沉淀物用 5 ～ 10 mL 热蒸馏水冲洗并同样离心，离心液并入容量瓶中（共 洗 2 ～ 3 次）定容，即为淀粉提取液。 3 ．取 5 ～ 10 mL 淀粉待测液，加入到盛有 2 mL 0.5 ％碘液的离心管中，混匀静置 15 min 后离心（ 3000 rpm ） 5 min ，弃上清液。沉淀用 5 ％的含碘硝酸钙溶液冲洗两次，向冲洗 后的沉淀中加入 10 mL 0.1 mol/L 的 NaOH 混匀，将离心管浸入沸水内 5 min ，使沉淀溶解。 将溶液转入 50 mL 容量瓶中，加入 0.3 mL 0.5 ％碘液，用 30 mL 左右的水冲洗并入容量瓶， 加入 2 mL 1mol/L 的盐酸，用水定容并显色，在 590 nm 波长处测定光密度。 4 ．绘制标准曲线 取标准淀粉溶液（ 1 mg/mL ） 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mL 于 6 个离心管中，用 80 ％硝酸钙溶液将各管的体积补足至 5 mL ，再向各管加入 2 mL 0.5 ％碘液，混匀静置 15 min 后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在 590 nm 波 长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mg ，然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。 四、结果计算 式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， mg 。 V T ——样品提取液总体积 , mL 。 V 1 ——显色时取样品液量， mL
W ——样品重（ g ）
W ——样品重（ g ）