第十七章高效液相色谱分析法HPLC (High Pertormance Liquid Chromatography, ·一、高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：109g(紫外检测)、1011g(荧光检测)
高效液相色谱法： 高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、 （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 第十七章 高效液相色谱分析法 高效液相色谱分析法 HPLC （High Pertormance Liquid Chromatography High Pertormance Liquid Chromatography，） 一、高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法的特点
(一)皿PLC与GC差别 1.分析对象的区别 GC:适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 晶，尤其对大多数生化样晶不可检测 占有机物的206 HPLC:适于溶解后能制成溶液的洋晶（包括 有机介质溶液)，不受样晶挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样晶及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物 的80%
（一）HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 ．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 ：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 ：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物 子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物 的80%
2。流动相差别的区别 GC:流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 PLC:流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3。操作条件差别 GC:加温操作 PLC:室温； 高压（液体粘度大，峰展宽小）
2．流动相差别的区别 ．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 ．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） ：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
(二)高效液相色谱仪流程图 贮液罐 (滤棒，可滤 贮液器 去颗粒状物质) 或样 输液系统 2.高压泵（输液泵） 高压系 进华器 3.进样装置 4. 色谱柱 分离 棒度洗脱 色 5。检测器 分析 装 柱 6.废液出口或组分收集器 7.记录装置 组分 记承仪 测器 收集器 爱据处理机 围194高藏液推色谱仪结构有快图
1．贮液罐（滤棒，可滤 ．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质） 去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） ．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 ．废液出口或组分收集器 7．记录装置 （二）高效液相色谱仪流程图 （二）高效液相色谱仪流程图
(三)HPLC的特点和实际应用 1、利用其高柱效(=104片/米)，有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等) 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物
（三）HPLC的特点和实际应用 的特点和实际应用 1、利用其高柱效（ 、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物
二、基本理论和条件选择 基础·热力学理论：塔板理论 平衡理论 理论·动力学理论：速率理论 Vander方程 (一)塔板理论 H理=Lln理 g5sr-1 k= to
二、基本理论和条件选择 二、基本理论和条件选择 基础 理论 热力学理论：塔板理论 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论 动力学理论：速率理论——Vander方程 （一）塔板理论 （一）塔板理论 理 = / nLH 理 2 2 21 2 )(16)(54.5)( W t W t t n R R R == = σ 理 eff eff = / nLH 2 21 ' 2 ' )(54.5)(16 W t W t n R R eff == 0 ' t t k R ∵ = 2 ) 1 ( k k nneff + =⇒ 理
(二)速率理论（与GC对比） 1. GC:H=A+B/u+C·M(填充柱) 或H=B/u+Cu(毛细管柱) A=21.dp Aoc入dp B=2y Dm =2y.D B octR,BcD。 T Dx或Dx C=Cm+Cs=Cg+C1=CI C oc D D
： / ⋅++= uCuBAHGC （填充柱） 或 / ⋅+= uCuBH （毛细管柱） = 2λ ⋅ dpA ∝ λ ⋅ dpA m DDB g = γ ⋅ = 22 γ ⋅ ∝ R ， ∝ DBtB g M T D T Dg 或 g ∝∝ η = + = + = CCCCCC llgsm l l D df C 2 ∝ η T DL ∝ 1. （二）速率理论（与 （二）速率理论（与GC对比）
2.HPLC:H=A+C·u(忽略纵向扩散项后) T B=2y.Dm Du c 柱温T↓低，流动相n个大→B相忽略 >讨论： 1)流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比） >l@0/5时H uH,n个一柱效个，但个 三兼顾柱效和分析时间，选择花=1m//m的 2)涡流扩散项及其影响 4=22dp Ad入·dp 2,dp→A三H↓，n↑三柱效个
2）涡流扩散项及其影响 ）涡流扩散项及其影响 ： = + ⋅uCAHHPLC （忽略纵向扩散项后） DB m ∵ = 2γ ⋅ η T Dm ∝ 柱温T ↓ 低，流动相η 大⇒↑ B相忽略 ↑↑↑⇒↓↓⇒ > ∝ R nHu t uHscmu ， ，但柱效 /1 时， ⇒ 兼顾柱效和分析时间，选择 = mlu min/1 2. ¾ 讨论： 1）流动相流速对 ）流动相流速对HPLC板高的影响（与 板高的影响（与GC对比） = 2λ ⋅ dpA ∝ λ ⋅ dpA λ ， ，nHAdp 柱效↑↑⇒↓↓⇒↓⇒↓
GC HPLC 图19.1GC和HPLC的典型的Ht曲线 1,B/u2,Cu3,A4.HLC的毒谁5.GC的4鼎推
3)传质阻抗项及其影响 C=Cm+Cm+C,≈Cm+Cm(忽略固定相传质阻抗) 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗 →HPLC:H=A+Cm·u+Cmu p C.=C T Dm c D dp↓→C→H↓，n↑一柱效个 7=Dnm↑一H,n↑一柱效个 T↑→Dm↑=→C↓，但易产生气泡 T→Dm↓，n个，柱阻个
3）传质阻抗项及其影响 ）传质阻抗项及其影响 = + + ≈ + CCCCCC smmssmm （忽略固定相传质阻抗 ） 忽略固定相传质阻抗 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 ⇒ ： = + m ⋅ + sm ⋅ uCuCAHHPLC m m sm D dp CC 2 == Dm dp C 2 ∝ η T Dm ∝ ，nHCdp 柱效↑↑⇒↓↓⇒↓⇒ η m ，nHD 柱效↑↑⇒↓↑⇒↓⇒ ↑↑↓↓⇒ ↓↑⇒↑⇒ ， ，柱阻 ，但易产生气泡 m η m DT CDT