实验二十一叶绿素的定量测定 一、原理 根据叶绿套对可见光的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度， 而后用公式计算叶绿素含量。 根据比尔定律，某有色溶液之光密度D应与其浓度C成比例，即： D=KC 式中，K为比例常数，当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1厘米时，K为该物 质的比吸收系数。 如欲测定叶绿体色素混合提取液（包括叶绿素a、b、叶黄素、胡萝卜素）中叶绿素a、b 的含量，只需测定该提取液在某一特定波长下的光密度D,并根据叶绿素a、b在该波长下 的比吸收系数即可求出两种叶绿素各自的浓度。为了排除黄色素干扰，所用单色光应选 择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a,b在红光区的最大吸收峰分别位于663纳米和645纳米；又已知在波 长663纳米下，叶绿素a、b的80%丙酮溶液的比吸收系数分别为82.04和9.27。在波长 645纳米下分别为16.75和45.60，可据此列出下列关系式： D63=82.04Ca+9.27C公式 (1) D4=16.75Ca+45.6C6公式 (2) 式(1)、(2)中的D63和D65为叶绿素溶液在波长663纳米和645纳米时的光密度， C,C,分别为叶绿素a和b的浓度。 解方程组(1)、(2)并转换成毫克·升-1单位得 Ca=12.7Dw-2.59D4s ) Cb=22.9D645-4.67D6s (4 将C与C相加，即得叶绿素总量Cr Cr=C,+C=20.3D64s+8.03D6 (5) 另外，由于叶绿素a、b在652纳米处有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此 波长下测定一次光度(D62)而求出叶绿素总量： Cm(毫克升-1)=×1000 34.5 (6) 二、试验材料、仪器和试剂 (一)仪器 ·175·
1.分光光度计：1台：2.研姊：1个3.量简：一个；4.剪刀：1把；5.50毫升量瓶1个6， 玻棒：7.4厘米漏斗1个；8.7厘米滤纸1张：9.滴管1支。 (二)试剂 80%丙酮 (三)材料 任何欲测的植物器官。 三、操作步骤 1.取样、剪碎、混匀，然后称取新鲜样品0.5g。 2.样品置研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及3毫升纯丙酮研成匀浆，再加80%丙酮 10毫升继续研磨至组织变为白色。 3.取滤纸一张，放入漏斗中用80%丙酮湿润，把提取液倒人漏斗中，滤人50毫升量 瓶里，用少量丙酮冲洗研体数次，最后连残渣一起倒人漏斗。 4,用滴管吸取80%丙酮，一滴一滴的将滤纸上的叶绿素提取液全部洗人量瓶内，直 到滤纸和残渣中无绿色止。最后用80%丙酮定容至50毫升。 5.把叶绿素提取液倒人光径1厘米的比色杯内，用分光光度计分别在波长645、652 和663纳米下测定光密度，以80%丙酮为空白对照。 6.按公式(3)、(4)分别计算叶绿素a、b的浓度（毫克升），相加即得总浓度，亦可按公 式(6)直接计算叶绿素总浓度 7求得叶绿素浓度后再按下式计算叶片的叶绿素含量 叶绿素合量（鲜重%）-C(毫克/升)×提取被总意（毫升）×100 样品鲜重（毫克）×1000 四、注意事项 1.为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。研磨时间应尽可能短些，以不超 过2分钟为宜。 2.用分光光度法测定叶绿素含量，对分光光度计本身的精确性要求较高，分光光度计 在使用前需对波长进行校正。校正的方法除按仪器说明校正外，还应以纯的叶绿素a和 b来校正。因为即使用国产仪器中性能较好的751型分光光度计，经校正后在600~700 纳米波段中的读数误差还可能有±2纳米，这对测定叶绿素a:b值已有影响。 176
实验二十五植物体内抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶的测定 一、原理 1.抗环血酸氧化酶在有氧情况下，能氧化抗坏血酸成脱氢抗坏血酸，同时促使其氢与 空气中的氧结合成水。 抗坏血酸氧化酶的测定是在该酸的最适pH及适直的温度下，向反应瓶中加人一定 量的底物（抗坏血酸）及酶提取液，让酶作用一段时间，然后测定底物被消耗的数量来计算 降的活性。 OH +0年化 0 OHC-H OH C-H CH2OH 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 抗坏血酸被消耗的量，则可用胰液滴定剩余的抗坏血酸而测定之。 K1O3+5KI+6HPO3→32+6KP03++3H0 0 +2HΠ OH C-H OH- CH2OH CH2OH 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 2.多酚氧化聘在氧的存在下，可将多酚类物质氧化为相应的醌；醒又能进一步氧化抗 坏血酸。 ·185·
OH- HO- OH- CH2OH CH2OH 邻 脱氢抗坏血酸 邻苯二酚 抗坏血酸 这种氧化还原关系是由于酚类物质与抗坏血酸之间的氧化还原电位差异而决定的。 酚类物质比抗坏血酸的氧化不原电位高；因而邻醇能夺取抗坏血酸上的氢，使自身得以还 原。因此，多酚氧化酶的测定与抗坏血酸氧化酶的测定类似，除了向反应体系中加人多酚 氧化酶的底物一多元酚类，还要如入抗环血酸。多酚氧化酶的活性，可以间接由抗坏血酸 的消耗量求得。 二、实验材料、仪翳和试剂 (一)仪器 1.研体一个： 2.50毫升量瓶一个；3.50毫升三角瓶6个；4.微量滴定 管1支；漏斗、吸耳球、滤纸5.5毫升移液管1支、2毫升2支、1毫升2支： 6.恒温水裕。 (仁)试剂 1.pH6.0的碘酸盐缓冲液；A液为115M磷酸氢二钠溶液；B液为115M醉酸二氢 钾溶液，取A液10毫升与B液90毫升混匀即可。 2.0.1%抗坏血酸，实验当天配制。 3.0.02M焦儿茶酚：称取0.22克焦儿茶酚溶于100毫升水中，实验当天配制。 4.10%偏磷酸 5.1%淀粉溶液。 6.0.005N碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸瘤水中，加冰酷酸1毫升，再加0.1N 碘酸钾(0.3567克澳酸钾溶于水，定裕至100毫升)12.5毫长，最后加蒸馏水成250毫 ·186·
(三)材料 马铃薯块茎、甘薯块根、植物叶片。 三、操作步骤 1.碑液提取：称取新鲜样品（叶子用2克，马铃薯块茎用4克）剪碎置研体中，加少量 石英及p6.0的碑酸盐缓冲液，迅速研磨成匀浆（事先将缓冲液用冰水冷却，不使研磨时 温度增高)。把全部材料用缓冲液洗人50毫升量瓶中，并用缓冲液定容至刻度。放在18 20℃水浴上浸提30分钟，中间摇动数次。将上清液（酶浸提液）倾人干净的三角瓶中备 用。 2.酶活性的测定：取6个50毫升洗净干燥的三角瓶，标上号码。 按下表先在各瓶中加缓冲液、抗坏血酸及焦儿茶酚：并向3及6号瓶加人1毫升偏深 酸。将三角瓶放人18~20℃水浴中，使内外温度平衡。每隔2分钟向各瓶中依次加人酶 液2毫升，准确记录加人酶液的时间。将各瓶在18一20℃水浴中保温3分钟后，立即按 原次序向1、2、4、5、号瓶各加入偏磷酸1毫升，以终止酶的活动。待反应瓶冷却后，各加 淀粉溶液3滴作指示剂，用微量滴定管以0.005N碘液进行滴定至出现浅蓝色为止。记 录滴定值。 、试剂（熹米 蒸馏水抗环血酸焦儿茶酚酶溶液偏磷酸备 注 瓶 4 2 2 测抗坏血酸氧化酶 2 4 2 2 同上 3 4 2 2 1 空白测定 4 3 2 测定抗坏血酸氧化酶 及多酚氧化酶 5 3 2 2 同上 6 321 2 1空白测定 3.酶活性的计算：酶活性以每克鲜组织每分钟氧化抗坏血酸的毫克数表示。计算方 法如下： (1)抗坏血酸氧化酶活性按下式计算； 抗坏血酸氧化酶活性（氧化抗环血酸毫克数.克鲜重1，分） 187
(w-当y)x0.4xY 2 wXt 式中，V一滴定3号空白所用去的0.005N碘液毫升数： V,一滴定1号瓶所用去的0.005N陕液毫升数： V2—滴定2号瓶所用去的0.005N碘液毫升数： 0.44 一每毫升0.005N碘液氧化抗坏血酸毫克数 V—提取液总体积（毫升）； 食—测定时取用提取液毫升数； W—样品鲜重（克）： 一测定时间（分）。 (2)多酚氧化活性：由于酶提取液中，包含有抗血酸氧化酶。在测定多酚氧化酶的反应 系统中(4、5、6号瓶)坑血酸的消耗量是两种酶作用的结果，因而在计算多酚氧化活酶性 的时候，必须减去抗环血酸氧化酶的活性。 多酚氧化酶活性按下式计算： 多酚氧化酶活性（氧化抗坏血酸毫克数.克鲜重1·分） [0w_y)-w-y+y]x0.4×当 2 2 wxt 式中，v -滴定6号空白用去的0.005N碘液毫升数； V- —滴定4号瓶用去的0.005N碘液毫升数； V,一滴定5号瓶用去的0.005N碘液毫升数 其余符号意义同前。 ·188
实验二十七光合呼吸速率的测定 一、原理 光合和呼吸均会引起环境中02含量的变化，因而可用02分析仪定量测定。 002分析仪测定植钩光合吸收02速率有两种方法：开放式和封闭式。开放式是以 空气能过叶室前后的0浓度差和它的计算0，的同化速率。封闭式则是反叶片放在 封闭系统内，根据气体体积和00含量下降速率来计算同化量。本实验采用开放式测定 方法。 二、方法步骤 1.净光合率的测定： (1)旋转三通阀T、T2、T,使气体由气系经T2进人叶室，然后经气泵、T由T排出。 调节螺旋夹，使气体流量适中（一般为0.5-1.5Lmin,可由流量计显示）。同时测定气源 002的含量。 (2)向隔热水槽注水，并使进出水量相等。 (3)打开光源。 (4)将持测叶片夹入叶室内。若测离体叶片，应在叶柄切口处套上小皮管供水。仔细 检查，勿使叶室漏气。 (5)待仪器指针稳定后（可由记录仪所画曲线确定）读数，并按下表所列项目记录各有 关参数。 红外线002分析仪测定记载表 净光合 呼吸 测定时间 光呼吸 大气OO2含量(C)ppm 经叶室后CO2含量(Cz)ppm 气流速度Lmi 叶室温度 照度 被测叶面积cm2 被测叶鲜重 mg 计算结果 191·
2.呼吸速率的测定 (1)测定净光合率后，关闭光源，叶室遮光。待仪器指针稳定后读数，并按上表项目记 录各有关参数 (2)若测定结果与气源002含量相差不大，可调节螺旋夹，降低气流速度，再测C0 含量。 (3)取出叶片，测量叶面积和鲜重 3.计算 净光和速率，呼吸速率和光呼吸速率可通用一个公式计算 即-00，人口00]出回×F××益4×2 10 Lr 式中：Pm—净光合速率，单位：mgC02.dm2.h1; Rp -呼吸速率，单位：mg002.gw-1,h1, L一光呼吸速率，单位同光合速率； [CO]B- -同化箱入▣空气的二氧化碳浓度(ppm): [0O2]也a -同化箱出口空气的二氧化碳浓度(ppm): F 流进同化箱中的空气流量(mlhr): 一同化箱温度（℃，实际是流量计内部的气温）： L一放在同化箱中的叶面积(cm2)。 三、注意事项 1.测光和速率前，应将植株置光下半小时以上，使气孔充分开张；叶片装人叶室后，光 合速率有暂时下降现象，以后逐渐上升，一般经15-20分钟方可恢复正常状态。所以读 数应在指针稳定后进行。所以读数应该在指针稳定后进行。 2.根据经验，测光合时△002值步应大于气源C02浓度（指大气C02浓度，约330 350ppm)值的20%，超出此范围，叶片可能会因C02亏缺而改变光合速率。例如：若气源 00,合量为350ppm,经叶室后，00，含量不应低于280ppm,低于该值时可通过加大气流 量或减少被测叶面积进行调节，使之达到适宜范围。 ·192·
实验三十植物细胞膜透性的测定 一、原理 植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时， 细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸人无离于水 中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加。组织受伤害越严重，电解质 含量增加越多。用电导仪测定外渗液电导率的变化，可反映出质膜受伤害的程度。在电 解质外渗的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液中可溶性糖、氨基酸、核苷 酸等含量增如。氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，用紫外分光光度计测定受伤害组织外 渗液消光值，同样可反映出质膜受伤害的程度。用电导仪法和紫外法测定结果有很好的 致性。 二、实验材料、仪器和试剂 (一)仪器 1.DDS-11A型电导仪；2.751-型紫外分光光度计： 3.真空泵；4.真空 干燥器； 5.三用水裕；6打孔器；7.剪刀；8.洗瓶；9.试管： 10.移液管；11.弦棒： 12.滤纸。 (二)试剂 去离子水。 (三)材料 小麦、玉米或其它欲测的作物。 三、操作步聚 (一)电导仪法 1,清洗器具：由于电导度变化非常灵敏，稍有杂质即产生很大误差。因此所用玻璃 器具均需先用热肥皂水洗，再用洗液洗涤，然后用自来水、无离子水各冲四、五遍（最好是 容器口朝下用水冲)。向洗净的试管中加入去离子水，用电导仪测定电导值，检查试管是 否确实洗净。 2.取样处理：选取小麦或其它作物一定叶位和叶龄的功能叶片，一份放入水中作为 对照，另一份放人50℃烘箱中或其它胁迫条件下使其菱驀，作为处理。对照和处理各取3 个叶片，用自来水洗去表面灰尘，再用去离子水冲洗一次，用干净纱布擦去水分。将叶片 196
叠起，剪取一厘米长的片段12个（或用打孔器打取12个叶圆片），放人试管内，用去离子 水冲洗一次，然后加人10毫升去离子水。对照和处理均设3一4个重复。 将试管放人真空干燥器内，开动真空泵抽气10分钟，以抽出细胞间隙空气。缓馒放 人空气，水即渗人细胸间隙。叶片变成透明状，细胞内溶质易于渗出。取出试管，间隔几 分钟振荡一次，在室温下保持20分钟。 3.测定：将DDS-11A型电导仪电极插人试管，测定外渗液的电导值。测定之后，将 试管放人沸水中5分钟以杀死组织。待冷至室温后，再次测定外滲液的电导值。 4.计算： (1)以细胞膜相对透性大小表示细胞受害的程度。通常按下式计算 细胞膜相对透性(%)=光×100 式中，L1一叶片杀死前外滲液的电导值；L2—叶片杀死后外渗液的电导值。 (2)直接计算细胞膜伤害率，通带采用下式计算； 伤害率(%)=-1气沿×1m 2 式中，C—对照叶片杀死前外渗液的电导值：C2一对照叶片杀死后外滲液的电导 值：T 一处理叶片杀死前外渗液的电导值；T2—处理叶片杀死后外渗液的电导值。 (仁)紫外分光光度计法 1.取样及处理：取样和处理方法与电导仪法相同。 2.测定：抽气后在室温下保持30分钟，其间振荡几次。倒出外滲液，用751型紫外分 光光度计测定外渗液对260纳米波长紫外光的消光值(1)。再给试管中加人10毫升去离 子水，放人沸水裕中5分钟杀死组织，待冷至室温后，测定外滲液的消光值(2)。 3.计算： 第胞膜相对透在(%)=A+A@×10 A 式中，A鼎—叶片杀死前外滲液消光值； A一叶片杀死后外渗液消光值 ·197