生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展
生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展
基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化
基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化
3重组DNA技术所需的基本条件 A用于核酸操作的工具酶 B用于基因克隆的载体 C用于基因转移的受体菌或细胞
3 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 C 用于基因转移的受体菌或细胞 用于基因转移的受体菌或细胞 B 用于基因克隆的载体 用于基因克隆的载体 A 用于核酸操作的工具酶 用于核酸操作的工具酶
3重组DNA技术所需的基本条件 A用于核酸操作的工具酶 狠制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 ●核酸修饰酶
A 用于核酸操作的工具酶 用于核酸操作的工具酶 3 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA DNA聚合酶 聚合酶 核酸酶 核酸酶 核酸修饰酶 核酸修饰酶
限制性核酸內切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 只别双链DNA分子中的特定序列,并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用 hsdR:编码限制性核酸內切酶 hsdM:编码限制性甲基化酶 hsds:编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年, Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind‖和HindⅢl
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列,并切割 分子中的特定序列,并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来 主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来DNA DNA的入侵 的入侵 细菌的限制与修饰作用 细菌的限制与修饰作用 hsd hsd R:编码限制性核酸内切酶 编码限制性核酸内切酶 hsd hsd MM::编码限制性甲基化酶 编码限制性甲基化酶 hsd hsd SS::编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968 1968年,年,Smith Smith等人首先从流感嗜血杆菌 等人首先从流感嗜血杆菌dd株中分离出 株中分离出 Hind II Hind II和和Hind III Hind III
限制性核酸內切酶 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 1型 ‖型 型 限制修饰 多功能 单功 双功能 蛋白结构异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2SAM Mg ATP Mgz+ SAM 识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列 GAGCC AACNGGTGC CAGCAG 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型 限制修饰 限制修饰 多功能 多功能 单功能 单功能 双功能 双功能 蛋白结构 蛋白结构 异源三聚体 异源三聚体 同源二聚体 同源二聚体 异源二聚体 异源二聚体 辅助因子 辅助因子 ATP Mg ATP Mg2+2+ SAM SAM ATP Mg Mg Mg2+2+ ATP Mg2+2+ SAM SAM 识别序列 识别序列 TGAN TGAN88TGCT TGCT 旋转对称序列 旋转对称序列 GAGCC GAGCC AACN AACN66GTGC GTGC CAGCAG CAGCAG 切割位点 切割位点 距识别序列 距识别序列1kb 1kb处处 识别序列内或附近 识别序列内或附近 距识别序列下游 距识别序列下游 随机性切割 随机性切割 特异性切割 特异性切割 24-26bp 24-26bp处处
限制性核酸內切酶 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名株名 Haemophilus influenzae d嗜血流感杆菌d株 Hindl dⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 属名 种名 株名 H i n d III H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae aemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸內切酶 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 EcoR|的切割位点 EcoR|的识别序列 5∴ GCTGAATTCGAG∴..3 3∴ C GACTTAAGCTC∴.5
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 II II 型限制性核酸内切酶的基本特性 型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4 - 8 对碱基的特定序列 对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构构 5‘ … G C T 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ C T T A A G C T C … 5’ EcoR I EcoR I的切割位点 的切割位点 EcoR I EcoR I的识别序列 的识别序列
EcoR等产生的5粘性末端 5∴ G-C-T-G-A-A-CGAG..3 3.cGAC-TA-A-GCTC∴.5 R|37C 5-C-T-G-OH P-A-A-T--C-G-A-G.3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-GCTC∴.5 退火47°C 5°. G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G∴3 3∴cGAC-TA- A G-C-T-C∴.5 P OH
EcoRI EcoRI等产生的 等产生的5‘ 5‘粘性末端 粘性末端 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ -C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ -G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoRI 37 EcoRI 37 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G- -C-T-G-OH P OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A- -G-A-C-T-T-A-A-P OH P OH--G-C-T-C … 5’ G-C-T-C … 5’ 退火退火 4-7 4-7 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ -C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’ -G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’ OHOH PP PP OHOH
Pst等产生的3粘性末端 5∴GCTC=TG-0A-GGAG∴33 3C-G-A-G-A-C-GPT-C-C-T-C.5 Pst 37 C 5°.GCTC-TG-C-A-0H P-G-G-A-G∴3 3∴cGA-G-P OHA-C-G- I-C-C-T-C∴.53 退火47°C 5°∴ G-C-T-C--G-C- A G-G-A-G∴.3 3∴cGA-GA=C-G-CCTC∴.5 P OH
PstI PstI等产生的 等产生的3‘ 3‘粘性末端 粘性末端 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ -C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ -G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 37 PstI 37 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A- -C-T-C-T-G-C-A-OH P OH P--G-G-A-G … 3’ G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G- -G-A-G-P OH P OH--A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 退火退火 4-7 4-7 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ -C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ -G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ OHOH PP PP OHOH