生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展
生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展
基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化
基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化
8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 A高等哺乳动物基因工程的基本概念 B高等哺乳动物的受体系统 C高等哺乳动物的载体系统 D高等哺乳动物的基因转移 E利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
D 高等哺乳动物的基因转移 高等哺乳动物的基因转移 8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 C 高等哺乳动物的载体系统 高等哺乳动物的载体系统 B 高等哺乳动物的受体系统 高等哺乳动物的受体系统 A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 高等哺乳动物基因工程的基本概念 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 A高等哺乳动物基因工程的基本概念 高等哺乳动物基因工程 高等哺乳动物转基因技术高等晡乳动物细胞基因表达技术 转基因动物个体 动物工程细胞 哺乳动物遗传性状改良 蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗
A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 高等哺乳动物基因工程的基本概念 8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 高等哺乳动物基因工程 高等哺乳动物基因工程 高等哺乳动物转基因技术 高等哺乳动物转基因技术 高等哺乳动物细胞基因表达技术 高等哺乳动物细胞基因表达技术 转基因动物个体 转基因动物个体 动物工程细胞 动物工程细胞 哺乳动物遗传性状改良 哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗 人体基因治疗 蛋白多肽物质大规模生产 蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型 药物筛选研究评价模型
8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 B高等哺乳动物的受体系统 高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞
B 高等哺乳动物的受体系统 高等哺乳动物的受体系统 8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞 常用的高等哺乳动物受体细胞
高等哺乳动物细胞的生长特性 正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征: ●锚地依赖性:细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 ●血清依赖性:细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性:细胞与细胞接触后,生长便受到抑制 ●形态依赖性:细胞称扁平状,并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中,一般只能存活50代 且在培养皿上以平面的形式生长,即单层细胞生长。有时,正常细胞 会改变某些特征而越过生理临界点,继续增殖并无限制分裂,这种状 态称为细胞系形成,此时的细胞成为细胞系
高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物细胞的生长特性 正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性： 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性： 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性： 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活 在体外培养中，一般只能存活50代50代 且在培养皿上以平面的形式生长， 且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞 即单层细胞生长。有时，正常细胞 会改变某些特征而越过生理临界点 会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状 ，继续增殖并无限制分裂，这种状 态称为 态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。 细胞系形成，此时的细胞成为细胞系
高等哺乳动物受体细胞的条件 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件 ●细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征,便于大 规模培养 传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失,易于长期保存 合适的标记便于转化株的筛选和维持 生长快且齐分裂周期短,生长均一,便于控制 ●安全性能好不合成分泌致病物质,不致癌 大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件,癌细胞能 满足上述前四项要求,但在安全性能上有欠缺
高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的条件 以高效表达外源基因为目标的高等 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件 哺乳动物受体细胞应具备下列条件 细胞系特征 细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 遗传稳定性 遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 合适的标记 合适的标记 便于转化株的筛选和维持 便于转化株的筛选和维持 生长快且齐 生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制 分裂周期短，生长均一，便于控制 规模培养 规模培养 大多数正常的高等哺乳动物细胞并 大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能 不能同时具备上述条件，癌细胞能 安全性能好 安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌 不合成分泌致病物质，不致癌 满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。 满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 嘌呤核苷酸生物合成途径 嘧啶核苷酸生物合成途径 5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP) 从头合成途径 氨基喋呤(AP) 尿嘧啶核苷一磷酸(UMP) 氨基喋呤(AP) GMP次黄嘌呤核苷一磷酸(HMP)■AMP胸腺嘧啶核苷一磷酸(TMP) 次黄嘌呤磷酸 胸腺嘧啶 (HPRT 核糖转移酶 核苷激酶 补救合成途径 次黄嘌呤核苷(HR) 胸腺嘧啶核苷(TR)
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 5-5-磷酸核糖 磷酸核糖-1- -1-焦磷酸（ 焦磷酸（PRPP PRPP）） 次黄嘌呤核苷一磷酸（ 次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP HMP）） 次黄嘌呤核苷（ 次黄嘌呤核苷（HRHR）） GMP GMP AMP AMP 尿嘧啶核苷一磷酸（ 尿嘧啶核苷一磷酸（UMP UMP）） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（ 胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP TMP）） 胸腺嘧啶核苷（ 胸腺嘧啶核苷（TRTR）） 嘌呤核苷酸生物合成途径 嘌呤核苷酸生物合成途径 嘧啶核苷酸生物合成途径 嘧啶核苷酸生物合成途径 次黄嘌呤磷酸 核糖转移酶 次黄嘌呤磷酸 （HPRT） 核糖转移酶 （HPRT） （（TKTK）） 胸腺嘧啶 核苷激酶 胸腺嘧啶 核苷激酶 氨基喋呤（ 氨基喋呤（APAP）） 氨基喋呤（ 氨基喋呤（APAP）） 从头合成途径 从头合成途径 补救合成途径 补救合成途径
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 含有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)编码基因缺陷的受体细胞(κ) 不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上(HAT培养基)生长,载体上的标记基因坎能与之遗传互补 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)编码基因缺陷的受体细胞 (hprt.) 不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上(HAT培养基)生长,载体上的标记基因hpt与之遗传互补
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -- ）） 不能在含有 不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上（上（HAT HAT培养基 培养基）生长，载体上的标记基因 ）生长，载体上的标记基因tktk能与之遗传互补 能与之遗传互补 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT HPRT）编码基因缺陷的受体细胞 ）编码基因缺陷的受体细胞 不能在含有 不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上（上（HAT HAT培养基 培养基）生长，载体上的标记基因 ）生长，载体上的标记基因hprt hprt与之遗传互补 与之遗传互补 （hprt （hprt -- ））
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记 遗传标记 编码产物 筛选药物 作用机理 APH氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418 DHFR二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤 HPH潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素B HPH灭活潮霉素B TK 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMP XG尸R黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸 XGPRT合成GMP ADA 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xy-A
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记 哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记 遗传标记 遗传标记 编码产物 编码产物 筛选药物 筛选药物 作用机理 作用机理 APH APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418 - 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418 DHFR DHFR 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 氨甲喋呤 DHFR DHFR变体抗氨甲喋呤 变体抗氨甲喋呤 HPH HPH- 潮霉素 B磷酸转移酶 潮霉素B HPH灭活潮霉素 B - 潮霉素 B磷酸转移酶 潮霉素 B HPH灭活潮霉素 B TKTK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMP - 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMP XGPRT XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP - 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP ADA ADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A - 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A