生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展
生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展
基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化
基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化
5目的基因的克隆与基因文库的构建 A鸟枪法 B CDNA法 CPCR法 D化学合成法 E基因文库的构建
5 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 C PCR C PCR法 B cDNA B cDNA法 A 鸟枪法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 基因文库的构建
5目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和 生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌 (细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。 般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然 后将之克隆表达
5 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和 生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌 (细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。 一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然 后将之克隆表达。 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和 生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌 (细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。 一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然 后将之克隆表达
5目的基因的克隆与基因文库的构建 A鸟枪法 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性
A 鸟枪法 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性 鸟枪法克隆目的基因的局限性
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段,然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段,然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段,然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端 全酶切 片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开, 大小不可控 部分酶切:片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载 体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体 转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杄菌作 受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体 染色体DNA DNA的切断 的切断 超声波处理: 超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端 片段长度均一,大小可控,平头末端 全酶切: 全酶切: 片段长度不均一,粘性末端便于 片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开, 连接,但有可能使目的基因断开, 大小不可控 大小不可控 部分酶切: 部分酶切: 片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整 片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整 与载体连接 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载 图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载 体;如果转化子采用基因产物功能检 体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体 测法筛选,则选择表达型载体 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作 为 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作 为 转化受体细胞 转化受体细胞 受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测 受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达 法筛选,则选择能使目的基因表达 的受体细胞 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立) 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)
鸟枪法操作的改进 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知 如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA, 然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高 重组子中目的重组子的出现频率
鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA, 然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA, 然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA DNA
鸟枪法操作的改进 在连接前将DNA片段进行分级分离 例如,已知某目的基因位于1.8kb的Sal 片段中,将染色体DNA用S叫切开,琼 脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于 1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块,从此 2.0kb 凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进 1.8kb 1.6kb 行拼接
鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 例如,已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中,将染色体DNA用SalI切开,琼 脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块,从此 凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进 行拼接 例如,已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中,将染色体DNA用SalI切开,琼 脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块,从此 凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进 行拼接 在连接前将DNA片段进行分级分离 片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb
鸟枪法操作的改进 凝胶DNA片段回收技术 冻融法 滤纸法 ●吸附法 氐融点凝胶法 ●溶解法
鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技术