生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展
生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展
基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化
基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化
7外源基因在酵母菌中的表达 A酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B酵母菌的宿主系统 C酵母菌的载体系统 D酵母菌的转化系统 E酵母菌的表达系统 F利用重组酵母生产乙肝疫苗
E 酵母菌的表达系统 酵母菌的表达系统 7 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 C 酵母菌的载体系统 酵母菌的载体系统 B 酵母菌的宿主系统 酵母菌的宿主系统 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 利用重组酵母生产乙肝疫苗 D 酵母菌的转化系统 酵母菌的转化系统
7外源基因在酵母菌中的表达 A酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌( Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物,分属于子囊菌纲(子囊酵母菌)、担子菌纲(担子酵母 菌)、半知菌类(半知酵母菌),共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统,则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 7 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 酵母菌的分类学特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌（ 酵母菌（Yeast Yeast）是一群以 ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞胞真核生物，分属于子囊菌纲（子 真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、 囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 担子菌纲（担子酵母 菌）、 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由 半知菌类（半知酵母菌），共由5656个属和 个属和500 500多个种组成。如 多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。 成熟的真核生物表达系统
7外源基因在酵母菌中的表达 A酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序,基因表达调控机理比较清楚,遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统( Generally Recognized As Safe GRAs) ●酵母菌是最简单的真核模式生物
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 7 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 酵母菌表达外源基因的优势 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA FDA认定为安全的 认定为安全的 基因工程受体系统（ 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS Generally Recognized As Safe GRAS）） 酵母菌是最简单的真核模式生物 酵母菌是最简单的真核模式生物
7外源基因在酵母菌中的表达 B酵母菌的宿主系统 ●广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
B 酵母菌的宿主系统 酵母菌的宿主系统 7 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括: 酵母属 如酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母( Kluyveromyces lactis) 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母( Pichia pastoris) 裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe) 汉逊酵母属如多态汉逊酵母( Hansenula polymorpha) 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽,但巴斯德毕赤酵母 表达外源基因最理想
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属 酵母属 如酿酒酵母（ 如酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae ）） 克鲁维酵母属 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（ 如乳酸克鲁维酵母 （Kluyveromyces lactis Kluyveromyces lactis ）） 毕赤酵母属 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（ 如巴斯德毕赤酵母 （Pichia pastoris Pichia pastoris ）） 裂殖酵母属 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（ 如非洲酒裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces pombe ）） 汉逊酵母属 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（ 如多态汉逊酵母 （Hansenula polymorpha Hansenula polymorpha ）） 其中其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究 酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但 最为详尽，但巴斯德毕赤酵母 巴斯德毕赤酵母 表达外源基因最理想。 表达外源基因最理想
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型 突变类型 生物效应 作用位点 SSc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶 SSc2 提高重组蛋白表达 转录后加工 rgr 提高重组蛋白表达 转录水平 ose1 提高重组蛋白表达 转录水平 SSc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y rho 提高重组蛋白表达 转录水平
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型 ssc ssc 11 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP ATP酶酶 ssc ssc22 提高重组蛋白表达 转录后加工 提高重组蛋白表达 转录后加工 rgr rgr11 提高重组蛋白表达 转录水平 提高重组蛋白表达 转录水平 ose ose 11 提高重组蛋白表达 转录水平 提高重组蛋白表达 转录水平 ssc ssc1111 改善重组蛋白分泌 羧肽酶 改善重组蛋白分泌 羧肽酶YY rho rho-- 提高重组蛋白表达 转录水平 提高重组蛋白表达 转录水平 突变类型 突变类型 生物效应 生物效应 作用位点 作用位点
抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团, 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖 链两部分组成。 能抑制超糖基化的突变类型 酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统,但野生突变类型 生物效应 型酿酒酵母对异源蛋白的 man 甘露糖生物合成缺陷型 糖基化反应很难控制, alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 超糖基化倾向,因此超糖 och外侧糖链添加缺陷型 基化缺陷株非常重要
抑制超糖基化作用的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 能抑制超糖基化的突变类型 能抑制超糖基化的突变类型 mnn mnn 甘露糖生物合成缺陷型 甘露糖生物合成缺陷型 alg alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 och och 外侧糖链添加缺陷型 外侧糖链添加缺陷型 突变类型 突变类型 生物效应 生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖 糖基核心 和外侧糖 链链两部分组成。 两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白 酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 质的糖基化系统，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。 基化缺陷株非常重要
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 靶蛋白 ys HOoC Ubiquitin76aa ubiquitin ligase E3 靶蛋白 ubiquitin ligase E3 靶蛋白s蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 泛素介导的蛋白质降解作用 蛋白酶体 蛋白酶体 Lys Lys HOOC Ubiquitin 76 aa Ubiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 ubiquitin ligase E3 Lys Lys ubiquitin ligase E3 ubiquitin ligase E3 Lys Lys 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白